论文部分内容阅读
【背景】近30年来肺癌的发病率、死亡率逐渐上升，肺癌已经取代肝癌成为世界上恶性肿瘤死亡原因的第一位。目前，对于肺癌来说最有效的治疗手段仍然是手术治疗，无法行手术治疗的肺癌患者只能接受药物化疗或者放射治疗。然而患者即使一开始对化疗非常敏感，化疗一定时间后也会出现化疗耐药，而且控制不了的肿瘤会出现转移，这就是肺癌患者高死亡率的重要原因。在非小细胞肺癌中MicroRNAs (miRNAs)已经被证明在肿瘤化疗耐药和转移的过程中扮演者重要的角色。TGF信号通路的异常在恶性肿瘤中显而易见，而这种异常通常都伴随着肿瘤的增殖、凋亡和转移。在本课题前期的研究中，miR-17,20a,20b被检测出相对于A549（顺铂敏感细胞）在A549/DDP(顺铂耐药细胞)中低表达。而在A549/DDP中高表达这3个miRNA会使之EMT状态变化从而使之对顺铂重新敏感还有减少细胞转移。miR-17,20a,20b起码有一部分功能是通过直接靶向和抑制TGF信号通路的重要基因TGF-beta receptor2(TGF R2)来起作用。因此我们猜测在非小细胞肺癌中miRNA17家族（miR-17,20a,20b属于miRNA17家族）能抑制TGF R2从而逆转顺铂耐药和抑制转移。【目的】寻找可以检测肿瘤顺铂敏感性和肿瘤转移能力强弱的标志物miRNA，并研究这些miRNA发挥作用的分子机制，为寻找预测顺铂治疗敏感性和转移能力强弱的标志物提供实验数据。【方法】1.体外细胞株，包括A549和它的耐药细胞株A549/DDP。2.miRNA基因芯片检测miRNA的表达，miRNA的表达结果进一步用qRT-PCR验证。3.细胞毒性试验：CCK-8细胞毒性试验用来检测转染了miRNA后细胞的生存状况，然后转染前后的细胞存活率对比。4.生物信息学软件预测miRNA的靶基因。5.在转染miRNA后利用qRT-PCR和Westrn blotting来验证靶基因的mRNA和蛋白表达。6.用双荧光素酶试验检测miRNA17,20a,20b是否直接靶向TGF R2。7.用transwell实验来检测细胞的迁移能力。8.利用小干扰RNA(siRNA) si-TGF R2沉默TGF R2后检测其mRNA和蛋白还有其顺铂耐药性。9.用免疫组化在人体组织中检测E-cadherin和Vimentin的表达情况。【结果】1.qRT-PCR结果显示: mir-17，20a，20b的表达在耐药株细胞A549/DDP较非耐药株细胞A549中显著降低，与芯片结果相符合。2.CCK-8试剂盒检测显示：A549/DDP转染mir-17，20a，20b的模拟物后，对顺铂的敏感性增加；而A549转染mir-17，20a，20b抑制物后，变得对顺铂耐药。3.细胞形态：A549表现出表皮细胞的型态但A549转染了mir-17，20a，20b抑制物后逐渐变成了间质细胞形态；而A549/DDP表现出间质细胞形态，A549/DDP转染了mir-17，20a，20b的模拟物后细胞变成了表皮细胞形态。4.用RT-PCR和Western blotting检测mRNA和蛋白的表达情况：A549/DDP细胞转染了miR-17,20a,20b模拟物后Vimentin的表达下降而E-cadherin的表达增加； A549细胞转染了miR-17,20a,20b的抑制物后Vimentin的表达上升，而E-cadherin的表达下降。而且这种情况mRNA和蛋白的结果是一致的。5.同transwell实验我们发现A549/DDP的迁移能力超过A549细胞。在A549/DDP细胞中转染了miR-17,20a,20b模拟物后细胞的迁移能力下降，A549细胞转染了miR-17,20a,20b的抑制物后细胞的迁移能力上升。这也表明miR-17,20a,20b能够在非小细胞肺癌中有效地调节转移。6.我们发现在A549/DDP中TGF R2无论mRNA还是蛋白的表达都比A549高，在A549/DDP细胞中转染了miR-17,20a,20b模拟物后TGF R2的mRNA、蛋白表达都下降；而A549细胞转染了miR-17,20a,20b的抑制物TGF R2的mRNA、蛋白反而上升。7.通过生物信息学软件，我们发现miR-17,20a,20b的潜在靶点TGF R2。8.分别构建带有野生型和突变型TGF R2基因的双荧光素酶报告质粒，通过双荧光素酶报告系统检测显示TGF R2是miR-17,20a,20b的直接靶点。9.利用小干扰RNA（si-RNA）沉默A549/DDP中TGF R2的表达后，细胞的EMT状态发生改变，Vimentin的mRNA和蛋白表达下降而E-cadherin的mRNA和蛋白表达增加，细胞的迁移能力下降还有细胞对顺铂重新敏感。10.免疫组化检测人体组织，原发癌的E-cadherin的表达比转移癌的高，而转移癌中Vimentin的表达却比原发癌中要高。【结论】1. miR-17,20a,20b的表达水平和与细胞对顺铂的敏感性相关联。2. miR-17,20a,20b能够调控EMT和细胞转移。3. miR-17,20a,20b能直接靶向TGF R2，并抑制其表达。4.抑制TGF R2的表达A549/DDP后细胞重新对顺铂敏感，迁移能力下降。