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目的：本研究应用基因工程技术方法，构建含重组编码CD13单链抗体和蝎毒素镇痛抗肿瘤缬精甘肽AGAP（analgesic antitumoral peptide，AGAP）融合蛋白基因的真核表达载体，在真核细胞中表达并纯化融合蛋白，并研究CD13-AGAP融合蛋白对CD13阳性白血病细胞株NB4影响。
方法：从东亚钳蝎蝎尾中PCR扩增东亚钳蝎活性肽AGAP的编码基因，酶切后插入真核表达载体pSecTag2/CD13/RFP，连接转化，酶切鉴定后得到pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体。测序鉴定后，LipofectamineTM2000脂质体转染试剂介导重组质粒转染293T细胞，通过RT-PCR和免疫印迹方法检测融合基因和蛋白在真核细胞中的表达。进一步用ProBondTM Nickel-Chelating Resin纯化柱结合并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP，低温冻干浓缩融合蛋白表达纯化融合蛋白。将CD13-RFP融合蛋白作用NB4细胞，室温孵育30 min，流式检测细胞红色荧光蛋白表达，分析CD13-RFP单链抗体融合蛋白特异性结合CD13阳性NB4细胞的能力；将CD13-RFP和CD13-AGAP融合蛋白作用CD13阳性白血病细胞株NB4细胞，CCK8检测细胞存活率；流式细胞仪检测CD13-AGAP融合蛋白对NB4白血病细胞株细胞周期的影响。
结果：
（1）酶切及测序结果证实pSecTag2/CD13/AGAP重组真核表达载体构建成功；
（2）将融合表达载体转染293T细胞，48 h后分别收集细胞总RNA和蛋白，RT-PCR和免疫印迹方法结果证实重组质粒得到有效表达；
（3）大量培养转染了CD13-AGAP融合蛋白表达质粒的293T细胞，液氮和42℃水浴反复冻融裂解细胞，用ProBondTM Nickel-Chelating Resin纯化柱结合并纯化真核表达融合蛋白CD13-AGAP，低温冻干浓缩融合蛋白；
（4）流式检测CD13-RFP单链抗体融合蛋白特异性结合CD13阳性NB4细胞，将CD13-RFP融合蛋白加入到1×105NB4细胞，室温孵育30 min，流式检测细胞红色荧光蛋白表达，发现有42%细胞CD13阳性，证明真核表达的CD13-RFP可以有效结合CD13阳性NB4细胞。
（5）将融合蛋白CD13单链抗体和CD13单链抗体AGAP融合蛋白作用白血病CD13阳性细胞株NB4，96 h后，对肿瘤细胞的生长抑制分别为16．3%和42．8%；
（6）流式细胞仪分析CD13-AGAP融合蛋白对NB4细胞周期的影响，融合蛋白CD13-AGAP处理NB4细胞后，使细胞周期G1期比例从对照的42．26%增加到55．97%多，S期从53．67%减少到38．18%。
结论：
（1）成功构建了融合蛋白真核表达载体pSecTag2/CD13/AGAP，并在293T细胞中成功表达并纯化融合蛋白.
（2）融合蛋白对CD13阳性的肿瘤细胞NB4有特异结合作用，结合了AGAP的CD13单链抗体融合蛋白可以有效抑制NB4生长，并且使细胞周期G1期阻滞，S期减少。