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目的 肿瘤疫苗(tumor vaccine)是指给机体直接或间接输入的具有抗原性的成分，它可刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应，用于治疗肿瘤。肿瘤细胞的抗原(antigen，Ag)绝大部分为细胞膜蛋白。收集其进行研究，对于寻找高效肿瘤抗原具有重要意义。本研究采用改良的Neville等方法收集不同分子量的人食管癌细胞株Eca-109细胞膜蛋白，寻找能引起免疫反应的肿瘤抗原，筛选出高效肿瘤抗原的大致范围，为食管癌的免疫治疗提供依据。 方法 树突状细胞(dendritic cells，DC)是已知抗原递呈能力最强的能激活初始T细胞的抗原递呈细胞(antigen-presenting cells，APC)，细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes，Tc，CTL)是进行特异性肿瘤免疫的主要效应细胞，辅助性T细胞(helper T cell，T_H，Th)在抗瘤免疫中也具有不可缺少的作用。纯化的这三种细胞，加上超滤法提取的膜抗原，能形成特异性抗肿瘤免疫反应。根据反应的强弱，可筛选出高效肿瘤抗原的大致范围。 1．提取Eca-109细胞膜蛋白：使用改良的Neville法先提取细胞膜。然后在pH 6.3的条件下，用去垢剂(detergent)Triton X-100和辛基β-葡糖苷(octyl β-glucoside)，把细胞膜上的蛋白溶解下来。 2．测定膜蛋白的浓度：用Bradford检测法，在pH 6.3、波长595nm处，制作蛋白标准曲线，测定含有去垢剂的各组膜蛋白浓度，推导出适当的去垢剂与膜蛋白之比郑州大学2003届硕士研究生毕业论文人食管癌Eca- 109细胞膜抗原筛选的初步研究 (即mg去垢剂/mg膜蛋白)。 3.以超滤法纯化膜蛋白并分组:以超滤法将膜蛋白从以TritonX一100作去垢剂的成分中按分子量大小分出<3KDa、3一10KDa、<l 0 KDa、10~30 KDa四个组;从以辛基p一葡糖昔做去垢剂的成分中分离出30~100 KDa、>l 00 KDa两个组，并测定各组膜蛋白浓度。 4.检测Eca一109细胞的HLA表型及筛选健康志愿者:使用HLA引物试剂盒，琼脂糖凝胶电泳(agamse gel eleetrophoresis)观察聚合酶链反应(polymerase ehain reaetion，PCR)扩增后的DNA产物，用扩增产物的有无鉴定出Eca-109细胞的HLA表型。采用血清学HLA分型技术，寻找至少有一个位点与Eca- 109细胞HLA相匹配的健康志愿者。 5.人外周血DC的培养:取筛选出的志愿者的外周血，密度梯度离心法获得外周血单个核细胞印eriPheral blood mononuclear cells，PBMC)，用含粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(g曲ulocyte一macrophage colony stimulating factor， GM一csF)、白细胞介素一4(interleukin一4，IL一4)及该志愿者血清的RPMI一1 640培养液调整细胞密度后，加入24孔板中培养。于培养的第4天，根据一定比例加入膜蛋白及hTNF一a刺激DC成熟，于第10天收获成熟的悬浮DC。 6.人外周血T细胞的培养:在IL一2维持下，流式细胞仪检测此志愿者PBMC的分化情况。根据检测结果，再提取PBMC，经过换培养瓶及PHA刺激，以含hIL一2的砂Ml一1640培养液常规培养PBMC4周，收集纯化的T细胞。 7.MTT法测定致敏T细胞的细胞毒活性:以纯化的T细胞为效应细胞，加入负载抗原的成熟DC，以8:1、16:1、32:l的效靶比分别加入Eca-109细胞(其为靶细胞);同时设阳性对照组、阴性对照组及效应对照组，各组设3个复孔，用MTT法在%孔板中测定CTL的细胞毒活性。 结果 1.在pH 6.3的条件下，适当的去垢剂与膜蛋白之比(即mg去垢剂/mg膜蛋白)，在使用辛基p一葡糖普时为6:1;使用TritonX一100时为2:1。 2.Eea一09细胞的HLA的基因分型为A，03，A，24;B，35，B，37;D拙l’01，DRBI’12;DRB3。并找到一例表型为A03杂合子的健康志愿者。 3.PBMC的分化情况:健康人PBMC，只在IL一2维持下，用流式细胞仪检测其分化情况。B细胞于第1周时基本死亡，第3周时完全消失;NK细胞于第1周时明郑州大学2003届硕士研究生毕业论文人食管癌Eca-109细胞膜抗原筛选的初步研究显增加，于第4周时大部分死亡;而第4周时，所培养的细胞绝大多数为T细胞。 4.根据MTT检测，Eca一109细胞小于10 KDa膜蛋白免疫原性(i~unogenicity)较未使用去垢剂的总膜蛋白的免疫原性高，而小于3 KDa膜蛋白的免疫原性最高。 结论 DC可递呈与HLA一I类、11类分子结合的Eca一109细胞膜抗原，引起特异性的抗肿瘤CTL免疫反应。Eca-109细胞膜蛋白中存在能引起CTL效应的肿瘤抗原，其膜蛋白小于3 KDa的成分中可能存在人食管癌的高效肿瘤抗原。