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关于植物根际促生菌（PGPR，plant growth-promoting rhizobacteria）促进植物生长和防治植物病害的研究，是一个农业科学前沿问题。胶原样蛋白(CLPs，Collagen-like proteins)在原核生物基因组中有较为广泛的分布，能介导微生物与其宿主之间的粘附作用。部分PGPR基因组中也发现有CLPs分布，其基因功能的研究目前还尚未报道过。解淀粉芽孢杆菌FZB42的CLPs是由其基因组上的4个基因组成的一个基因簇，本研究中分别将其命名为clpP、clpB、clpC和clpD。本文主要从生物学功能、蛋白表达定位和介导细菌一植物互作等方面对CLPs进行了研究，并取得了以下研究结果: 1.CLPs基因编码的氨基酸序列均具有典型胶原序列特征 4个CLPs基因分别编码产物的一级结构具有共同特征，均由三个结构域组成，序列中部含有典型胶原样重复序列(Gly-X-Thr)，N-和C-末端含有非胶原结构域序列。对4个基因编码产物进行氨基酸残基序列比对结果显示，ClpA和ClpB的C-末端序列具有60％的同源性，ClpB和ClpC的N-末端有52％的同源性，ClpB和ClpC的C-末端也有30％的同源性。生物信息学数据库分析和软件预测发现，ClpB和ClpC的N-末端序列上均含有潜在半乳糖结合结构域，ClpD的C-末端序列存在跨膜结构域。以上分析表明，4个CLPs是典型的胶原样蛋白，彼此末端序列间的同源性可能存在相互协同作用关系。 2.CLPs有助于细菌生物被膜形成 针对4个CLPs基因构建了突变体菌株，并对突变体和野生型的菌株生物被膜形成、粘附性、自聚集等特性进行了差异分析。主要研究方法包括:singlecrossover构建CLPs突变株、光学电镜和扫描电镜观察、生物被膜测定、细胞表面疏水值测定和细胞沉降实验。实验结果显示，clpA、clpB、clpC和clpD基因突变失活后，各突变株形成生物被膜的能力有不同程度的显著下降，而且CLPs突变株的胞外基质呈现扁平状片层，且与细胞壁有明显分离现象，CLPs突变体细胞表面的疏水值相对于野生型显著减小。野生型菌株较CLPs突变株的细胞间呈聚集状，细胞沉降实验显示CLPs突变株的细胞间粘附减小、沉降速率显著变快，证实CLPs对细胞间相互粘附发挥作用。这些实验结果表明，CLPs是参与细菌生物被膜形成的重要蛋白，能够影响细胞间自聚集、粘附性和胞外基质特性。 3.CLPs在细菌鞭毛表面表达 采用免疫标记的手段，对解淀粉芽孢杆菌CLPs在细胞中的亚细胞定位进行了研究。主要研究方法包括:重组CLPs克隆、蛋白诱导表达和纯化、anti-CLPs多克隆抗体制备、场透射电镜观察、免疫胶体金标记、免疫印迹、细菌运动和slide-culture实验等。实验结果显示，5个CLPs的C-或N-末端多肽被成功诱导表达和纯化，并获得了免疫家兔的anti-CLPs特异性多克隆抗体。抗体anti-ClpB-N和anti-ClpC-N免疫胶体金标记的FZB42细胞，金颗粒信号大多集中出现在细菌鞭毛表面。对鞭毛总蛋白的粗提物进行免疫印迹分析，证实了ClpB和ClpC是鞭毛蛋白的组分。细菌运动结果分析显示，ClpB和ClpC突变株的运动能力显著低于野生型，且菌落边缘运动形态也有显著差异。这些结果表明，ClpB和ClpC是在FZB42细菌鞭毛的表面蛋白，推测可能是一种粘性蛋白粘附于鞭毛表面，且影响了细菌运动能力。 4.CLPs提高了FZB42在拟南芥根表面的定殖能力 利用CLPs突变株，对解淀粉芽孢杆菌FZB42在拟南芥根表面的初期粘附和后期定殖能力进行了分析。分析拟南芥根表面的细菌，主要采用了CFU统计和扫描电镜观察的方法。实验结果显示，CLPs缺失后FZB42在聚乙烯表面的粘附数量显著低于野生型。CLPs突变株在拟南芥根表面初期的粘附数量也显著减少，而且在拟南芥根部的定殖数量也显著低于野生型。因此，CLPs对于FZB42在拟南芥根表面的定殖能力起到了重要作用。 综上所述，本研究首次揭示了PGPR细菌CLPs的生物被膜形成功能和在鞭毛上的表达定位，以及细菌与植物相互作用的分子基础过程，表明CLPs是PGPR促生和生防不可或缺的重要蛋白。该研究结果，为开发基于解淀粉芽孢杆菌的新型微生物菌肥农业应用工程菌株提供了理论基础，对农业生产中的减少化肥使用、保护土壤、提高作物产量和防治作物病害均具有重要意义。