毛细管电泳分析肺癌基因及相关蛋白质的方法学研究

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肿瘤是多因素作用下,多阶段演化而成。随着各种检测技术的发展及学科之间的渗透,一些肿瘤生物指标从最初的分子生物学检测发展到化学检测。本论文以分析化学的检测方法毛细管电泳(CE)对肺癌DNA,蛋白质进行分析,并对聚环氧乙烷(PEO)中添加纳米材料金纳米粒子(GNPs)后的新型筛分介质进行研究。   第一部分从DNA角度以CE、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结合经典突变点分析方法:单链构象多态性(SSCP)和限制性片段长度多态性(RFLP)对肺癌及癌旁正常组织p53基因第七外显子突变情况进行检测,从上样量、时间、检测限和检出率四个方面进行比较。检出率由高到低分别为:CE-SSCP>PAGE-SSCP>CE-RFLP>PAGE-RFLP。CE-SSCP可作为大规模肺癌早期诊断DNA指标简便可靠的方法。   第二部分首先建立无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光(NGS-CE-LIF)检测蛋白质的方法,改进后对提取肺癌及癌旁正常组织蛋白质混合物(变性/活性)差异进行检测。该法可对6.5~200kDa范围蛋白质进行分离,具有筛分介质浓度调节简便、分离效果好、时间短等优点,理论塔板数(N)均值为9.12×104/m,检出限为2.8×10-4 mg/ml。肺癌组织与正常组织相比有较明显蛋白质种类及表达量差异,且主要集中在20~116kDa。常用蛋白质分析方法:变性 SDS-PAGE及活性蓝绿温和胶电泳(BN-PAGE)结果与NGS-CE-LIF结果大致相同,并且PAGE检测不出的蛋白质CE-LIF也能检测出来。   第三部分合成13 nm的GNPs,透射电子显微镜(TEM)对GNPs尺寸进行测量,以PEO-GNPs-TBE(Tris-Boric acid-EDTA)作为CE筛分介质,考察分离参数:筛分介质浓度,分离电压,温度和筛分介质pH值对DNA片段分离的影响。用Ogston模型、偏爬行模型解释相关实验现象,对分离机理进行初步研究。结果表明添加GNPs的这种新型筛分介质分离效果好且时间短,适于分离较宽范围(100~10000bp)的DNA片段。分离机理较符合偏爬行模型,但又有所不同。DNA分子的电泳迁移率与尺寸成反比,且呈一定的线性关系:用线性关系y=-kx+b能更好解释这种筛分介质分离DNA片段的机理。   CE在DNA,蛋白质分析方面的应用,具有高效、快速、灵敏度高等优点;新型纳米材料的应用也为检测方法的改进及检测效率的提高提供了可能。前期的基础工作可为芯片、质谱等各种技术的联用及肿瘤检测提供科学依据。
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