莱茵衣藻光合突变体筛选及OHP基因功能研究

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光合作用是植物和蓝藻利用太阳能将无机物转化为有机物并放出氧气的过程,直接或间接的为地球上绝大多数生物提供物质和能量,是生物界赖以存在的基础。光合作用是一个重要且极其复杂的生理生化过程,其分子调控机制是目前重点研究的前沿科学问题之一。莱茵衣藻是光合作用研究重要的模式生物,其基因组学研究揭示出众多未知功能基因的存在,阐明它们的功能是后基因组时代一项重要的研究任务。本硕士论文以莱茵衣藻为材料,采用外源DNA随机插入法构建插入突变体,通过巴龙霉素的抗性筛选转化子,获得了库容为3000的衣藻突变体库。利用叶绿素荧光(PSⅡ最大光量子产量和PSⅡ实际光量子产量)筛选,获得了31个光合突变体,其PSⅡ实际光量子产量降低了50%以上。通过Tail-PCR进一步的分析,初步确定了6个突变体的质粒插入位点。这些突变体的获得,为进一步的基因功能研究奠定了材料基础。与此同时,采用反向遗传学方法对衣藻捕光色素类似蛋白家族的OHP(One-helix Protein)基因的功能进行了探讨。通过人工干扰小RNA(amiRNA)及基因过表达构建了OHP基因敲减藻株及过表达藻株。对它们在正常和高光胁迫条件以及活性氧胁迫处理下的生长表型及光合生理生化特性进行分析,进一步对有GFP标签的OHP过表达藻株进行了蓝绿温和胶电泳分析和免疫共沉淀分析,获得了如下主要发现:1)与野生型相比,敲减藻株的PSⅡ最大光量子产量Fv/Fm及实际光量子产量Y(Ⅱ)均降低;2)OHP敲减藻株的生长速度较野生型藻株低;3)在高光胁迫处理下(750μmolphotons·m-2·s-1),OHP敲减藻株的Fv/Fm与Y(Ⅱ)比野生型降低更快;4)外源活性氧胁迫处理实验表明,敲减藻株对活性氧的抗性降低;5)对OHP-GFP过表达藻株的膜蛋白BN/PAGE及免疫印迹分析发现,OHP位于PSⅡ单体所处的位置;6)免疫共沉淀分析表明OHP与D1、D2蛋白有相互作用。这些研究结果表明,OHP可能通过与反应中心蛋白的相互作用影响PSⅡ的功能。
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