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类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis,RA)是一种慢性全身性炎症性疾病,属于自身免疫炎性疾病,其危害性严重、致残率高,严重影响患者的生活质量。RA的病因及发病机理迄今并不十分清楚,目前针对RA采取的治疗主要集中在缓解疼痛、减轻炎症、减少不良反应、保护肌肉以及维持关节功能等方面。临床上用于治疗RA的常用药物主要有非甾体类抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂及中药制剂。这五类RA治疗药物均存在明显的缺陷与不足,譬如缺乏明显的特异性、有严重的毒副反应、患者平均用药时间短、治疗价格昂贵、产品质量难以控制等等。寻找疗效确切、毒副作用小的抗RA新药势在必行。
过山枫(CelastrusaculeatusMerr.)是卫矛科南蛇藤属植物之一,亦是我国民间久用的治疗类风湿性关节炎的中药材,具有肯定的疗效和坚实的临床基础。但有关过山枫所含化学成分及治疗RA的物质基础方面的研究工作国内外鲜见报道。本文以过山枫作为研究对象,对过山枫抗RA活性部位与活性成分进行深入分离分析,以便为过山枫治疗RA提供药效物质基础。获得的主要结果如下:
1、通过简便快速的MTT法,证实过山枫乙醇提取物石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位及氯仿萃取部位,均能使体外培养的T淋巴细胞增殖受到明显抑制。这说明过山枫乙醇提取物的弱极性萃取部位具有抗炎活性作用,即过山枫治疗RA的物质基础存在于过山枫乙醇提取物之弱极性萃取部位之中。
2、采用大孔吸附树脂柱色谱等分离技术,从过山枫乙醇提取物中提取分离出具有抗类风湿关节炎及免疫调节作用的有效部位(过山枫总三萜),并通过紫外分光光度法、HPLC等对其含量进行测定。同时,为过山枫抗类风湿关节炎有效部位的制备建立了一条适合工业化生产要求的技术路线。有关参数如下:对于柱床体积为15mL的HPD-100大孔吸附树脂,过山枫乙醇提取物乙酸乙酯萃取物的上样浓度为1mg/mL、上样流速为0.25mL/min、上样量低于2BV、洗脱剂为80％乙醇水溶液、沈脱剂用量为8BV、洗脱速度为1mL/min。按照该工艺纯化后的过山枫总三萜,其含量达到60%以上。这表明非极性的大孔吸附树脂HPD-100能有效地纯化过山枫总三萜。
3、应用高速逆流色谱分离技术,配合HPLC法对过山枫化学成分进行了初步探讨,并从其石油醚提取部位分离纯化出3个单体化合物,纯度分别达到97.1%、95%、95.3%。经过IR、1HNMR、13CNMR及HR-MS等波谱学方法表征,通过查阅比对已知化合物库,证明这3个单体化合物分别是具有醌甲基结构特征的五环三萜化合物扁蒴藤素、只有17个碳原子的具备三环二萜结构的nimbidiol和五环三萜化合物雷公藤酚A。其中,扁蒴藤素是从南蛇藤属过山枫中首次分离出来的化合物,nimbidiol与雷公藤酚A则是整个南蛇藤属植物中首次分离纯化获得的已知化合物。且扁蒴藤素与雷公藤酚A均为过山枫抗类风湿关节炎的活性成分。
4、通过醋酸扭体实验与毛细血管通透性实验证实了过山枫总三萜具有较强的镇痛抗炎作用。并以斑马鱼血管抑制模型分别对从过山枫中分离纯化得到的扁蒴藤素、nimbidiol及雷公藤酚A进行活性筛选。初步试验结果表明,nimbidiol在10～15μg/mL浓度范围内,能有效抑制斑马鱼节间血管的形成,并具有浓度依赖性。这表明nimbidiol具有较强的抑制新生血管生成作用,在过山枫治疗RA过程中起到有效抑制RA滑膜细胞血管形成的作用。因此,过山枫治疗RA至少是通过抗炎镇痛与抑制RA滑膜细胞血管新生两方面的作用来实现的。本实验同时也证实nimbidiol具有较强的抗癌活性作用,是过山枫的抗癌活性成分之一。
5、测定了过山枫总黄酮的体外抗氧化活性作用。实验结果表明,过山枫总黄酮对DPPH·、ABTS、·OH三种自由基都表现出较强的清除或抑制作用,并且在试验浓度范围内随着过山枫总黄酮浓度的增大,其对DPPH·、ABTS、·OH三种自由基的清除或抑制作用增强,且呈明显的量效关系。通过与VitC体外抗氧化活性的阳性比较,证明过山枫总黄酮清除或抑制自由基的能力比相同浓度下的VitC稍强,这说明过山枫总黄酮具有较强的抗氧化活性,具备作为天然抗氧化剂的潜在开发价值。