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背景: 青光眼滤过手术是当前治疗青光眼的重要手术方法,但是手术后滤过泡的瘢痕化是影响手术成功率的主要因素。滤过泡的瘢痕化与多种致纤维化因子的活性密切相关,其中转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的作用至关重要,其亚型TGF-β2在眼部瘢痕疾病的发生中又起主要作用。TGF-β与其Ⅱ型受体(TGF-βreceptor Ⅱ,TβRⅡ)结合作为致组织纤维化的始动环节,促使成纤维细胞转分化为具有收缩功能的肌成纤维细胞,在瘢痕化的发生中起关键作用。因此,通过拮抗或者阻抑TGF-β与TβRⅡ的结合,可为青光眼术后抗瘢痕治疗提供新的方法。目前利用具有靶向性的适配子及抗体可实现对上述过程的干预。本课题组在前期的研究中使用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到了靶向TβRⅡ的核酸适配子S58,并证明了适配子S58可抑制TGF-β介导的人Tenon’s囊成纤维细胞(human Tenon’s capsule fibroblasts,HTFs)的转分化作用,但是核酸适配子存在易被核酸酶降解、作用时效短等缺点。而瘢痕修复大约从术后第三天开始,直至术后一个月左右瘢痕完全形成。因此保持适配子的生物活性,延长其作用时间很重要。化学性修饰,如硫修饰能够增强核酸的稳定性,但同时增强了其细胞毒性及非特异效应。因此,选择一种有效且安全的方法来保持核酸适配子的生物活性,显得很有必要。壳聚糖(chitosan)是一种天然的阳离子聚合物,因为其良好的生物降解性、生物相容性、较低的免疫原性,以及突出的大分子粘附能力,近年被广泛应用于大分子、核酸、蛋白质的载体研究中。已有研究发现壳聚糖纳米化后作为寡核苷酸的载体,可有效保护寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此,将壳聚糖纳米微粒作为核酸适配子S58的载体,有望成为保持并延长S58生物活性的一种理想手段。 目的: 本研究拟在合成一种靶向TGF-βⅡ型受体的新型核酸适配子-壳聚糖纳米微粒复合物CS(S58)-NP,并对其特性及抑制TGF-β介导的人Tenon’s囊成纤维细胞转分化进行研究。 方法: 首先使用离子交联法制备出不同壳聚糖纳米微粒(chitosan-nanoparticles,CS-NP)与适配子S58摩尔比的CS(S58)-NP;然后应用动态光散射法检测CS(S58)-NP的粒径及其Zeta电位;用扫描电子显微镜观察粒径的大小、形态及分布情况;采用琼脂糖凝胶电泳法检测CS-NP与S58的结合情况,并评估CS(S58)-NP对血清的抵抗能力;体外缓释实验检测CS(S58)-NP缓释S58的情况;激光扫描共聚焦显微镜观察异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的CS(S58)-NP与HTFs的结合情况;利用乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测CS(S58)-NP对HTFs的细胞毒性;最后使用westernblot法检测平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况。 结果: 1.CS(S58)-NP的粒径分布于137.2~274.6nm之间,并且随着CS-NP与S58摩尔比的增大而减小,Zeta电位分布于+4.54~+27.7mV之间,并且随着CS-NP与S58摩尔比的增大而增大;扫描电子显微镜下可观察到CS(S58)-NP为球形微粒,分布均匀,粒径大部分在300nm以内;CS(S58)-NP的包封率最高达到了91.7±7.4％;CS-NP/S58摩尔比为20和30的CS(S58)-NP,CS-NP与S58结合较为完全;CS-NP/S58摩尔比为20和30的CS(S58)-NP抗血清酶解能力超过48小时,缓释S58达到96小时。 2.激光共聚焦显微镜下能够观察到FITC标记的CS(S58)-NP与HTFs结合;当CS(S58)-NP使用浓度为25nM时,LDH相对释放率为6%左右,使用浓度增至100nM时,LDH相对释放率为20%左右,CS(S58)-NP在有效作用浓度下表现出良好的生物相容性。 3.TGF-β介导的α-SMA表达受到CS(S58)-NP的明显抑制,且成浓度依赖性,使用浓度为100nM时可抑制α-SMA表达达60%左右;在血清存在的情况下,S58在6小时内具有明显抑制α-SMA表达的作用,CS(S58)-NP在12到48小时时间段表现出明显的抑制作用。 结论: CS(S58)-NP具有明显的适配子保护能力、稳定的缓释特性、较低的细胞毒性等特性,因此壳聚糖纳米微粒可应用到适配子载体的研究中。TGF-β介导的α-SMA表达受到CS(S58)-NP的明显抑制,且即使在血清存在的情况下,该抑制作用也较未经包裹的裸适配子S58长。我们的结果发现适配子S58经壳聚糖纳米微粒包裹以后,可用于抑制TGF-β介导的人Tenon’s囊成纤维细胞转分化研究中。