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鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestife,RA)感染是严重危害家鸭、火鸡和其它鸟类的一种接触性传染病。目前对R.anatipestifer的致病机理研究较少。磷脂酶广泛存在于动物、植物和细菌体内,是专一性水解甘油磷脂的一类酶。Patatin样磷脂酶(patatin-like phospholipase,PLP)和外膜磷脂酶A(outer membrane phospholipase A,OMPLA)都具有磷脂酶A的活性,是革兰氏阴性菌重要的致病因子之一。
鸭疫里默氏杆菌patatin样磷脂酶(RaPLP)及外膜磷脂酶A(RaOMPLA)基因全长序列的克隆:根据本实验室构建的RA1基因组表达文库及ivi基因筛选获得一长444 bp的Raplp部分序列,以改良的SiteFinding-PCR方法延伸序列,扩增获得了一长4662 bp的序列。生物信息学分析显示,Raplp基因的完整ORF为2061 bp,推导氨基酸为686 aa,与其它物种PLP氨基酸序列的相似性最高为23％,具有保守活性位点Ser16-Asp160。依据NCBI上已发表OMPLA的氨基酸序列(由pldA基因编码),利用生物信息学方法分析其保守结构序列,应用CODEHOP(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)在线软件设计简并引物,PCR扩增获得一长428 bp的RapldA基因部分序列;根据此序列与其它细菌的pldA基因序列进行比对分析,参照E.coli pldA基因序列设计上下游延伸引物,扩增获得了一长3400 bp的序列。生物信息学分析显示,RapldA基因的完整ORF为870 bp,推导氨基酸为289 aa,与其它物种OMPLA氨基酸序列的相似性最高为99％,并含有一个保守的Motif"YTQ-Xn-G-X2-H-X-SNG"及相同的活性位点Ser164-His162-Asn205。
RaPLP和RaOMPLA的克隆表达、蛋白纯化及酶动力学分析:本研究利用原核表达载体pCold TF及宿主菌E.coli BL21(DE3)pLysS进行Raplp及RapldA的重组表达,得到与预期大小一致的融合蛋白,分别为:126.1 kDa和81 kDa。利用Ni-NTA纯化体外重组表达的RaPLP与RaOMPLA,纯化后得到单一的目的条带。应用8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)作为疏水探针,测定体外重组表达酶的活性,进行了酶动力学与抑制动力学分析,结果显示,rRaPLP对十四酰磷酸胆碱(1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DMPC)的Km=12.7 μM,Vmax=319.5 nmol/mim rRaOMPLA对DMPC的Km=9.3μM,Vmax=315.5 nmol/min。本研究应用甲基花生四烯酸氟化磷酸酯(methyl arachidonyl fluorophosphonate,MAFP)对rRaPLP及rRaOMPLA进行了初步的抑制动力学分析,MAFP对rRaPLP及rRaOMPLA抑制的IC50分别为:0.81±0.07μM和1.73±0.06μM。
Ra⊿plp::erm和Ra⊿ldA::erm突变体的构建:以pDS132.为自杀质粒,通过同源重组的方法构建Ra⊿plp::erm及Ra⊿pldA::erm的插入突变体。以质粒pBluescript ⅡSK构建带有ermB基因的同源重组臂⊿plp::erm及⊿pldA::erm,将得到的同源重组臂连接到带蔗糖敏感基因(sacB)的自杀质粒pDS132上。以转化了重组自杀质粒pDSl32-⊿plp::erm或pDS132-△pldA::erm的大肠杆菌132155为供体菌,RA1型菌株为受体菌进行接合转移。以含有红霉素及蔗糖的培养基直接筛选突变体,结果表明,同源重组臂△plp::erm及△pldA::erm能成功整合到R.anatipestifer的基因组中,且抗性基因ermB能稳定表达。将突变体Ra△plp::erm及Ra△pldA::erm与亲本菌株进行OD600测定,绘制生长曲线,结果表明,两株突变体与亲本菌株的生长曲线没有明显变化。突变体毒力试验表明,Ra△plp::erm毒力较亲本菌株降低了1倍,Ra△pldA::erm降低了3倍。
本研究首次克隆获得并重组表达了R.anatipestifer的plp和pldA基因,重组表达产物rRaPLP与rRaOMPLA具有磷脂酶A的水解活性,MAFP对rRaPLP与rRaOMPLA的体外酶活性具有抑制作用,以同源重组的方法构建突变体Ra△plp::erm与Ra△pldA::erm,对其生物学特性的研究发现突变体的毒力较亲本株有所下降,证实RaPLP及RaOMPLA是R.anatipestifer的潜在致病因子。