广东省PRRSV流行病学调查及XH株Nsp2部分缺失全长cDNA的构建

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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为特征的传染病。迄今为止,该病己给世界养猪业造成了巨大的经济损失。   在PRRSV的全基因组中,Nsp2基因变异最大,对该基因变异的分析在一定程度上能够反映PRRSV整个基因组变异的情况。本研究采用RT-PCR方法,从临床发病猪的病料中扩增出PRRSV的Nsp2基因,得到17株PRRSV Nsp2基因的部分序列片段。序列测定和分析发现,扩增的17株Nsp2部分基因序列均有两个区域存在明显缺失。   应用DNA Star分析软件与GenBank中已发表的其他毒株序列进行核苷酸相似性比较,结果表明:17株Nsp2序列之间的核苷酸同源性为93.7~100%,与CH-1a、CH1R和VR-2332的核苷酸序列同源性分别为74.8~77.5%、75.1~77.8%和65.6~66.3%,与疫苗株MLV的同源性在65.9~66.1%之间,与HB-1(sh)2002、HEB1的同源性分别为78.4~81.8%、94.3~97.2%,而与HUN4、JX143、XH-GD等高致病性蓝耳病代表株的同源性分别为95.2~98.4%、95.5~98.4%、94.9~100.0%之间。参考国内外已经发表的Nsp2基因序列,采用分子生物学软件MEGA4绘制了PRRSV的系统进化树,结果表明:17株Nsp2与PRRSV经典株VR-2332、疫苗株MLV的遗传关系较远;与国内分离的高致病性PRRSV毒株JXA143、HUN4、XH-GD的遗传进化关系较近,属同一分支。   本研究,对2009至2011年,来自广东省地区部分猪场的411份血清样品及107份组织病料进行检测发现,所有被检测猪场均存在不同程度的PRRSV感染,全部猪的PRRSV的平均抗体阳性率为53.53%(220/411)。仔猪的抗体阳性率为49.45%(45/91),种公猪的抗体阳性率为42.00%(21/50),后备母猪的抗体阳性率为53.90%(76/141),经产母猪的抗体阳性率为60.47%(78/129)。PRRSV病原阳性率为62.62%(67/107),PRV病原阳性率为3.74%(4/107),PCV2病原阳性率为42.98%(46/107)。变异株占PRRS阳性感染的91.04%(61/67)。从本调查结果可以看出,同一猪群,猪的年龄越大,PRRSV抗体阳性率越高。本研究发现PRRSV抗体的阳性率与PCV2抗体阳性率有较强的相关性,并且,PRRSV病原阳性率(62.62%)与PCV2病原阳性率(42.98%)有很大相关性,这种相关性有待于进一步研究。   本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒XH株Nsp2基因序列的高变区域,设计了8对引物,覆盖PRRSV-XH株Nsp2基因组的cDNA重叠片段△A1、△A2、△B1、△B2、△C1、△C2大小应分别为2115bp、720bp、2109bp、1008bp、2451bp、720bp。通过融合PCR的方法,最终扩增出三类关于PRRSV-XH株Nsp2部分基因序列缺失的cDNA片段,并将它们分别克隆入pJET1.2Blunt载体,对这些亚克隆进行大量测序后,与亲本毒株PRRSV-XH株进行比对,筛选出与亲本相同的亚克隆,然后将获得的正确克隆依次连接并克隆到低拷贝质粒载体pokq中,最终获得了三株关于PRRSV-XH株Nsp2部分缺失的全长cDNA重组质粒pokq-△ABCD。为进一步研究Nsp2的基因序列的缺失与PRRSV毒力之间的关系奠定了基础。
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