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布鲁菌病(Brucellosis)是由布鲁菌(Brucella spp.)引起的一种严重威胁人类健康的全球性重要的人畜共患传染病,给畜牧业发展和人类健康造成了极大的危害。世界动物卫生组织(OIE)将布鲁菌病列为B类动物疫病,我国列为二类动物疫病。布鲁菌是一种革兰氏染色阴性的胞内寄生的细小杆菌,主要通过消化道、皮肤粘膜和呼吸道等途径侵入机体而发生感染和发病,其主要寄生于网状淋巴组织,造成免疫系统病理进程,并常伴随有菌血症,对生殖、神经和骨骼系统造成严重损害。牛、羊、猪等家畜是布鲁菌病的主要传染源,要从根本上控制布鲁菌病既要建立相应的快速诊断方法,还要研制新型疫苗,这样才能更好的切断布鲁菌病的传播。
本研究首先建立了牛布鲁菌与牛分枝杆菌的双重PCR方法,然后建立了布鲁菌新型可视化LAMP检测方法,并对这些方法进行了初步应用,为布鲁菌病的快速诊断提供了新的途径;另外,还构建了布鲁菌bp26基因缺失株S19-Abp26、M5-Abp26、S2-△bp26,为新型布鲁菌标记疫苗的研制奠定了基础。
近年来,随着人们生活水平的提高和饮食结构的改变,乳制品消费量迅速上升,污染牛布鲁菌和牛分枝杆菌的乳制品可成为人类布鲁菌病及结核病的一大威胁。本研究根据GenBank中已公布的流产布鲁菌种特异的omp25基因序列及牛分枝杆菌特异保守的16SrRNA加工蛋白rimM基因序列,设计了2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了牛布鲁菌和牛分枝杆菌的快速鉴别检测方法,该方法特异性和敏感性试验结果显示,对牛布鲁菌和牛分枝杆菌分别扩增出448 bp、269 bp的特异性条带,而大肠杆菌、沙门菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、军团菌、枯草杆菌及溶血性链球菌均无任何条带。该方法对牛布鲁菌和牛分枝杆菌染色体DNA的最低检出量均为10 pg;对人工污染牛布鲁菌、牛分枝杆菌牛奶样品的检测敏感度分别为7.9×103 CFU/mL、3 ng/mL。该方法的建立,为牛布鲁菌及牛分枝杆菌在乳制品中的快速检测奠定了基础。
本研究还基于布鲁菌种特异omp25基因建立了一种布鲁菌的新型可视化环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。应用该方法分别对布鲁菌弱毒株S19、S2、M5进行检测,均显示阳性,而大肠杆菌、沙门菌、八叠球菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、军团菌、枯草杆菌及溶血性链球菌的检测均显示阴性。对扩增产物电泳图谱及AluI进行酶切分析验证,其LAMP产物特异。敏感性结果显示,该方法对布鲁菌染色体DNA的最大检测度均为10 pg。应用该方法对人工污染牛布鲁菌的牛奶样品进行检测,其检测敏感性可达1.3×103CFU/mL:还应用该方法对感染布鲁菌小鼠的组织进行了检测,为布鲁菌新型可视化LAMP检测方法的进一步应用奠定了基础。研究表明,建立的布鲁菌新型可视化LAMP检测方法具有快速、特异、敏感、无需昂贵仪器及结果可视化等优点,在临床上应用具有巨大的潜力。
最后,我们还根据布鲁菌的基因组结构特点,选择含有反向筛选基因sacB标记的pRE112质粒为自杀载体,利用等位基因交换的方法成功缺失了布鲁菌弱毒疫苗S19株、S2株、M5株的bp26基因,构建了具有非抗性基因标记的缺失突变株S19-△bp26、S2-△bp26、M5-△bp26。通过电转的方法将构建的重组自杀质粒pRE-△bp26(缺失了bp26基因的681个碱基)电转入布鲁菌后,再经过5μg/mL,氯霉素筛选单交换子和7％蔗糖筛选同源重组双交换子,最后用菌落PCR方法及DNA序列测定的方法进行验证,结果表明,3株布鲁菌弱毒株S19、S2、M5的bp26基因缺失改造成功,对构建的3株bp26基因缺失布鲁菌连续传20代后经PCR鉴定及DNA序列测定均显示构建的3株bp26基因缺失株具有遗传性稳定。构建的无抗性基因标记的布鲁菌弱毒基因缺失株为布鲁菌的基因功能研究奠定了基础,对有效区分布鲁菌疫苗免疫与布鲁菌自然感染,新型疫苗的研制及布鲁菌病的防制与净化具有重要意义。