论文部分内容阅读
金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotixn B,SEB)是金黄色葡萄球菌分泌的一种可溶性蛋白质,属革兰氏阳性热源外毒素,也是一种重要的细菌超抗原.因此微量的SEB就可非特异性地激活5-20%的T细胞,释放大量的细胞因子,促进CTL细胞成为效应细胞并激活NK细胞,从而产生强大的抗肿瘤效应.但由于SEB具有较大的毒副作用,容易导致人和动物伪膜性小肠炎、大肠炎,引起呕吐、腹泻,甚至死亡<[2]>.为了研究SEB结构中的组氨酸与其毒性的关系,减轻并消除SEB的毒性作用,促进SEB在肿瘤治疗的临床应用.为此,我们通过PCR定点突变技术,在SEB三维结构的基础上,用其它氨基酸替代SEB的组氨酸,构建六个SEB突变体,并通过一系列实验检测各种突变体蛋白的活性.从而筛选出毒副作用较小、超抗原活性较好的突变体.该实验主要包括两个部分:1.突变体蛋白的获得;通过引物设计及PCR定点引入H12、H32、H105、H121四个突变位点,形成六个突变体:SEB-H12D/H32D、SEB-H105D/H21D、SEB-H12D/H32D/H105D/H121D、SEB-H32D、SEB-H32Q、SEB-H32L.将PCR扩增的突变DNA片段与pET32a原核表达载体连接,构建成6个重组表达质粒,诱导表达并得到高纯度的突变体蛋白.2.突变体蛋白的活性检测;通过对肿瘤细胞的抑制实验,脾淋巴细胞增殖实验以及MHCⅡ亲和实验,初步检测突变体蛋白的超抗原活性;然后通过幼猫催吐实验检测突变体蛋白的毒性,用小鼠致死实验检测突变体蛋白在体内的超抗原活性作用.在此研究中,我们成功地定点引入了突变位点并构建了突变体的原核表达质粒,得到了高纯度的SEB突变体蛋白(纯度>95%).肿瘤细胞的抑制实验和鼠脾增殖实验结果表明:各突变体仍然具有刺激淋巴细胞增殖的能力,并保持了对肿瘤细胞的抑制作用,但与对照组(野生型SEB)相比有所降低.MHCⅡ亲和力实验证明:各突变体蛋白与MHCⅡ类分子均具有较高的亲和力,其中四位点突变体(AB)与MHC Ⅱ类分子结合的荧光强度为220.32,比野生型SEB荧光强度高了一倍;而突变体C3的亲和力却比野生型SEB低了一倍,荧光强度为52.33.催吐实验显示:各突变体蛋白均没有引起实验动物的呕吐、腹泻中毒症状.致死实验表明:所有突变体对小鼠的致死性都有不同程度的降低,尤其是四位点突变体AB(致死率为50%),其致死性比野生型SEB低了一倍;突变体C3具有较高的致死性,但与阳性对照组相比无差异.总之,上述实验表明:SEB结构中的组氨酸被替代后毒性明显减弱,但其T细胞刺激活性也受到不同程度的影响.