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激发子是一类能够诱导寄主植物产生防卫反应的化合物的总称,经植物受体识别后,可诱导植物防卫基因的表达,最终表现为对病原菌的抗病性。植物病原来源的激发子是调节寄主与病原互作的重要信号物质,其诱导植物产生抗病性是植物病理学研究的热点之一。近些年来受到广泛关注的蛋白质组学研究,对从蛋白质整体水平研究激发子诱导的植物抗病性的分子机制提供了良好的技术平台。
本论文以抗病(丰甜一号)和感病(粤甜九号)两个不同品系的甜玉米为材料,以玉米小斑病菌O小种(Cochlibolus maydis race O)胞壁纯化激发子BM042压伤斑处理玉米叶片,经不同时间采样,对玉米抗性相关酶活进行了分析,并研究了激发子预处理后对玉米的诱导抗病性。同时应用双向电泳、图像分析、质谱鉴定等蛋白质组学技术,研究了玉米小斑病菌激发子处理后,玉米植株体内的蛋白质表达差异,以了解激发子诱导玉米抗病性的可能机制。实验结果如下:
1.O小种菌丝经反复冻融、离心、清洗,获得胞壁组分,胞壁组分经匀浆,离心,硅藻土过滤,获得澄清上清,上清经Millipore PM10超滤膜超滤浓缩、去除小分子物质,以AKTA Purifier100层析仪过DEAE弱阴离子柱、S-200凝胶柱层析,获得纯化玉米小斑病菌O小种胞壁激发子BM042。
2.BM042经IEF等电聚焦电泳,等电点约为4.3,SDS-PAGE电泳分析,分子量约为42 KD,将纯化激发子BM042进行LTQ质谱鉴定,结果显示为预测蛋白jgi∣CocheC5_1∣103456∣estExt_GenewiselPlus.C60789,与S-腺苷高半胱氨酸水解酶家族蛋白有较高同源性。
3.以不同纯度的激发子接种抗病和感病两个品系的三叶一心期甜玉米第三片叶,发现对12 h,24 h,36 h,48 h,72 h五个不同时间段PAL,POD酶活性均具有诱导升高作用,激发子纯度与诱导酶活呈正相关。激发子预处理的抗病、感病两个品系玉米的发病程度明显低于空白对照。激发子诱导抗病最低有效浓度为20μg/mL。
4.纯化激发子接种三叶一心期甜玉米第三片叶,以缓冲液处理为空白对照,分别于12 h,24 h采样,采用TCA丙酮法提取叶片总蛋白,进行双向电泳,Bio-RadPDQuest8.0软件分析电泳图谱,选取两时间段内变化规律一致的差异蛋白点共23个进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,其中20个蛋白鉴定成功。12 h新增蛋白点N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9,12h消失蛋白点V1、V2、V3、V4,12h上调表达蛋白点U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7,12h下调表达蛋白点D1、D2、D3。24h新增蛋白点N1、N2、N3、N9,24h消失蛋白点V1、V2、V3、V4,24h上调表达蛋白点U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7,24h下调表达蛋白点D1、D2、D3。经生物信息学分析,按照蛋白质功能,可将差异表达蛋白质分为5类:防卫相关蛋白3个;光合作用相关蛋白5个;代谢相关蛋白3个;氧化还原相关蛋白2个(非差异表达蛋白);未知蛋白10个。