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木质纤维素是地球上含量最丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素等成分构成。木质纤维素可经预处理和纤维素酶水解转变为葡萄糖等单糖，后者可经微生物发酵生产纤维素乙醇，这一途径的开发和工业化对缓解当前日益严重的能源危机和温室效应具有重要意义。然而，木质纤维素中的纤维素组分因氢键而形成结晶结构（纤维素微纤丝），而且纤维素微纤丝又和半纤维素、木质素等通过氢键形成牢固的复杂网络结构，使得木质纤维素难以被纤维素酶水解。纤维素酶对纤维素的水解效率低下是纤维素乙醇工业化生产的主要瓶颈之一。植物扩张蛋白是从植物细胞壁中分离的一类蛋白，它没有水解酶活性，但可以破坏纤维素微纤丝之间或微纤丝和其它细胞壁多糖之间的氢键，具有松弛细胞壁结构和促进细胞生长的功能。Swollenin是丝状真菌中与植物扩张蛋白同源的一类蛋白，它也具有破坏植物细胞壁和棉纤维结构的功能。纤维素难以被纤维素酶降解的主要原因是因氢键而形成的牢固结构，因此，能破坏氢键的Expansin和Swollenin有可能成为促进纤维素酶水解活性的辅助因子。寻找新的Expansin或Swollenin、深入研究其作用机制可为提高纤维素酶的水解活性提供新的途径。本文从海洋水样中筛选到一株纤维素酶活力较高的草酸青霉菌株(Penicillium oxalicum HZ-7)，克隆了其swollenin基因，实现了该基因在里氏木霉的高效重组表达和纯化，深入研究了该蛋白对纤维素酶水解效率的促进作用。相关的研究结果如下：
⑴获得了纤维素酶活较高的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株。在广东深圳南澳、红树林和惠州等海域采集海水，在以羧甲基纤维素(CMC)为唯一碳源的平板上筛选到约100个菌株。经液体培养和纤维素酶活力测定，约20个菌株具有较明显的纤维素酶活，其中一株HZ-7活力达到1.7FPU/mL，高于常见菌株里氏木霉QM9414。用形态学观察、18SrDNA序列分析和Biolog微生物自动分析系统等技术对HZ-7进行分类学鉴定，确定菌株HZ-7为草酸青霉（Penicillium oxalicum）的一种菌株。
⑵从草酸青霉(P.oxalicum)克隆到一个新的swollenin基因。根据已公布物种的swollenin基因序列设计保守引物，从P.oxalicumHZ-7基因组DNA中扩增到该菌株swollenin基因的一个保守片段poswol。在此基础上，通过TAIL-PCR技术，扩增到HZ-7swollenin基因的5’端和3’端未知编码序列。通过拼接，得到了HZ-7完整的swollenin编码序列，共1905bp，命名为poswollenin。氨基酸序列分析表明，Poswollenin与公布的其它物种的Swollenin具有较高的同源性。将poswollenin基因序列提交NCBI数据库，登录号为HQ291307。本文还用生物信息学软件对Poswollenin蛋白的理化性质、蛋白稳定性、糖基化位点、二硫键位置，保守结构域等进行了预测和分析。与已报道的swollenin基因的克隆策略相比，本文采用的poswollenin基因克隆策略具有简单、快速、高效的特点，对丝状真菌其它物种新的swollenin基因的克隆具有一定参考价值。
⑶构建了一个里氏木霉组成型高效表达T载体。本文用前期克隆的里氏木霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的启动子构建了一个组成型表达T载体pAN-PSGT。该载体从重组质粒的构建、转化到目的蛋白的表达和利用都具有便利和高效的优点：(1)该载体通过XcmⅠ酶切，可以直接连接PCR产物，并能在大肠杆菌和丝状真菌高效转化和筛选；(2)pAN-PSGT含有gpd启动子和cbh1信号肽，能实现目的基因的组成型高效分泌表达，而且表达的蛋白质不会在N端增加任何氨基酸，能最大限度地保留蛋白的原始结构和活性；(3)胞外的目的蛋白不会混杂纤维素酶等杂蛋白，提高了纯度，便于后续的应用。用pAN-PSGT对里氏木霉木聚糖酶XynⅡ进行了组成型表达。结果表明，重组XynⅡ的表达量为20mg/L，是诱导条件下内源性XynⅡ表达量的10倍，而且胞外上清中目的蛋白的纯度较高，为XynⅡ直接应用于造纸工业上的生物制浆、纸浆漂白、报纸脱墨等过程带来了便利。用pAN-PSGT对其它10个同源或异源蛋白进行组成型表达，结果表明，该载体在表达分子量与三磷酸甘油醛脱氢酶分子量(36kD)相差不远的蛋白时效果显著。用pAN-PSGT实现了草酸青霉Poswollenin的重组表达，分子量为81kD，表达量约1mg/L。
⑷构建了一个诱导型高效表达载体，并实现Poswollenin的高效分泌表达。本工作利用里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的启动子、信号肽和终止子，构建了一个诱导型表达载体pPIC-P-T。通过将目的基因插入pPIC-P-T的SfiⅠ和NotⅠ位点之间，能实现目的基因在里氏木霉的诱导型分泌表达。由于SfiⅠ和NotⅠ这两个酶切位点在各个物种的基因组中都比较罕见，因此载体pPIC-P-T具有良好的通用性。将poswollenin基因插入pPIC-P-T，成功实现了该基因在里氏木霉的诱导型分泌表达，表达量达到100mg/L以上，比组成型Poswollenin表达量提高100倍以上，说明载体pPIC-P-T在介导重组蛋白，尤其是分子量较大的蛋白的分泌表达方面具有较高的效率。利用草酸青霉重组Poswollenin N末端的6×His Tag，运用亲和层析等方法对Poswollenin进行了蛋白纯化，结果表明，纯化的Poswollenin纯度达95％以上，回收率约19％。同时，使用载体pPIC-P-T，能较好地克服蛋白含有较多半胱氨酸时形成错配二硫键的问题，与大肠杆菌表达系统相比具有明显优势。
⑸Poswollenin可促进纤维素酶水解效率。将Poswollenin与纤维素酶对微晶纤维素进行同步反应，结果表明，当Poswollenin用量为10～30μg时，纤维素酶用量为0.002FPU时，纤维素酶对纤维素的水解效率提高0.5倍，说明Poswollenin与纤维素酶之间具有较好的协同作用，协同度达到1.5。为消除Poswollenin与纤维素酶之间可能存在的竞争作用，将Poswollenin与纤维素酶对微晶纤维素进行分步反应，结果表明，使用10μg Poswollenin对底物进行预处理，纤维素酶对微晶纤维素的酶解效率能提高1.5倍，协同度达2.5。而Poswollenin单独与微晶纤维素反应，不产生明显可检测的还原糖。关于Poswollenin促进纤维素酶水解作用机制的初步研究表明，Poswollenin能使滤纸崩解、滤纸屑大量脱落；使微晶纤维素颗粒变细，整体更松散。经过Poswollenin预处理的微晶纤维素，能吸附更多的纤维素酶。根据上述结果，推测Poswollenin能破坏纤维素的结晶结构，使其趋向无定型化，这样，增加底物的可及性，促进酶在底物上的有效吸附，从而提高了纤维素的酶解效率。
⑹本文在木质纤维素的利用方面与传统上完全依靠纤维素酶不同，采用Poswollenin与纤维素酶的协同方式，通过在纤维素酶水解体系中引入一个能破坏纤维素结晶结构的非酶因子，来促进纤维素酶的催化效率，因此是一个利用木质纤维素的新途径。该途径能提高木质纤维素的利用效率，降低纤维素酶的使用成本，对木质纤维素的工业化应用和缓解日益严重的能源危机具有重要的现实意义。同时，Poswollenin与C1-Cx假说中的C1性质相似，这为C1因子的存在提供了证据，表明在纤维素酶催化体系中可能存在非酶因子。swollenin基因的物种普遍性提示了含非酶因子的催化机制的普遍性。因此，Poswollenin的研究结果具有在纤维素酶催化机制方面的理论意义。