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目的:应用神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)移植联合粒细胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF)对新生大鼠缺氧缺血性脑病(Hypoxic Ischemic Encephalopathy, HIE)模型进行治疗,从整体水平、细胞水平、分子生物学水平观察治疗后的效果,为临床更有效的治疗新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-Ischemic Encephalopathy, HIE)提供理论基础。方法:1. NSCs的制备及鉴定取人胚胎脑组织,培养获取生长旺盛的NSCs球,分散制成含小细胞球的细胞悬液,加入50μg/ml的DAPI溶液标记细胞核,待移植用。应用免疫荧光方法,以抗-神经巢蛋白(Nestin)鉴定细胞NSCs特性。诱导分化后,以抗β-Ⅲ-tubulin抗体鉴定神经元,抗GFAP抗体鉴定星形胶质细胞。2.模型动物分组及G-CSF注射7日龄Wistar乳鼠,麻醉后双重结扎并剪断左侧颈总动脉,恢复2～4小时后,放入8%O2+92%N2的容器中2.5小时,用水浴箱控制环境温度在39℃左右。将存活动物随机分为三组,HIE组(A组),NSCs移植组(B组),NSCs移植+G-CSF治疗组(C组)。其中C组于建模完成后1h给予G-CSF,注射剂量为50μg·(kg·d)-1,每天一次,连续注射5天。3. NSCs移植B组和C组动物在模型制作后第2天行NSCs移植,将幼鼠麻醉后固定在立体定向仪上,将制备好的NSCs(细胞浓度约为1×105/μL)悬液5μL匀速缓慢注入左侧(损伤侧)侧脑室,A组动物移植入等量生理盐水。移植后不予免疫抑制剂。4.行为学及解剖观察建模完成后以及设定时间点对各组大鼠进行mNSS评分,并对各组大鼠大脑重量进行测定,行TTC染色,比较大脑梗死灶。5.组织检测设定时间点将各组大鼠断头取脑,按实验内容不同分别制作石蜡、冰冻切片,行HE及Nissl染色,观察大脑神经元的损伤情况,应用免疫荧光方法检测植入细胞存活、迁移、分化情况。通过图像处理软件进行细胞计数及统计学分析,对比B组和C组植入细胞存活、迁移、分化情况。结果:1. NSCs的鉴定人胎脑组织分离的细胞体外培养获取生长旺盛的干细胞球,免疫荧光标记后,大部分细胞表达NSCs标志Nestin,诱导分化后,对分化细胞进行神经元、星形胶质细胞标记物β-Ⅲ-tubulin、GFAP的鉴定,证明所获细胞具有NSCs特性,且DAPI标记后不影响其活性。2. NSCs移植移植后可见DAPI阳性的植入细胞存活,并向周围扩散,分布集中在海马、额叶皮层、脑干和小脑,细胞形态与所处脑组织部位的细胞形态相似。3. mNSS评分建模完成后所有大鼠的mNSS评分较高。NSCs移植后,移植组评分较对照组明显降低,且C组评分较B组评分明显减低,表明经联合治疗后大鼠的运动行为能力有所改善。4.解剖学NSCs移植后1周和2周大脑重量明显高于A组(F值分别为42.38和121.76,P<0.01),且C组大脑重量明显高于B组(t值分别为2.36和2.63, P<0.05);NSCs移植后4周大脑重量明显高于A组(F=58.22,P<0.01),B组和C组比较无显著性差异。TTC染色显示移植后C组梗死灶体积较A组减小。5. HE染色及尼氏染色移植后2周,A组皮层神经元及海马锥体细胞变性坏死,细胞呈空泡状,尼氏小体缺失;B组病理变化较A组轻,细胞排列较有序,仍可见斑点状神经元变性、坏死;而C组细胞排列相对整齐,形态较规则,未见变性坏死的神经细胞,细胞内布满深蓝色尼氏小体。6. TUNEL检测NSCs移植术后3天,B组大脑皮层见大量的植入细胞处于凋亡状态,而C组的植入细胞凋亡明显减少(181.07±14.16/20倍视野VS 73.20±14.01/20倍视野),差异具有统计学意义(t=68.37,P<0.01)。7.免疫荧光NSCs移植术后1、2、4周观察B组和C组大脑组织中植入细胞。①通过DAPI检测到植入细胞从脑室向外迁移,损伤侧可见DAPI阳性细胞存在,以额叶皮层和海马多见,纹状体及颞叶皮层亦有少许植入细胞分布。B组的阳性细胞数少于C组(726.31±142.33/mm2 VS 851.04±105.75/mm2),差异具有统计学意义(t=14.07,P<0.01 )。植入后2周,更多的移植细胞到达损伤区,B组植入细胞数仍少于C组(923.45±121.49/mm2 VS 944.64±117.55/mm2),差异有统计学意义(t=2.5,P<0.05)。植入后4周,2组细胞数量均有所减少,细胞计数差异无统计学意义(t=1.47,P>0.05)。②通过DAPI+β-Ⅲ-tubulin双标检测到植入细胞分化成的神经元。其分布以皮层、海马为主。移植后1周,皮层部位两组植入细胞分化的神经元数量上差异无统计学意义(t=1.66,P>0.05)。而海马各区主要位于颗粒细胞层,C组神经元分化存活数量较B组多,差异有统计学意义(t=3.02,P<0.01)。移植后2周,皮层及海马C组神经元分化存活数量较B组多,差异有统计学意义(t值分别为4.78和2.87,P<0.01)。③通过DAPI+GFAP双标检测到植入细胞分化成的星形胶质细胞。其数量较少,见于纹状体、白质,皮层亦可见散在分布,移植后1周,C组植入细胞分化的星形胶质细胞数量较B组多(53.57±18.22/mm2 VS 47.42±17.81/mm2),差异有统计学意义(t=4.83,P<0.01)。移植后2周,两组植入细胞分化的星形胶质细胞数量上差异无统计学意义(t=1.59,P>0.05)。④通过DAPI+Olig2双标检测植入细胞分化成的少突胶质细胞。NSCs植入侧脑室后,几乎不能分化成少突胶质细胞,偶可见到DAPI和Olig2双阳性细胞,两组差异无统计学意义。结论:1.人胎脑组织在体外含EGF和bFGF的无血清培养基中培养可获得NSCs球,具有NSCs特性,且DAPI标记后不影响其活性。2.移植至HIE大鼠脑内的神经干细胞能存活、迁移并分化成神经元及星形胶质细胞。3. NSCs移植联合G-CSF能更有效地促进大脑重量增加,修复病理损伤,促进神经功能修复,且植入细胞存活率及向神经细胞分化的比率增加。