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基因NYD-SP5是Lan-Lan Yin等在人睾丸cDNA microarray差异杂交的基础上,克隆的一个新的成人睾丸高度表达的基因。它由3598个核苷酸组成,包括1027个氨基酸开放阅读框架。序列分析显示基因NYD-SP5与小鼠睾丸基因AK019535的核苷酸序列及其编码蛋白BAB31783的氨基酸序列具有很高的同源性。这表明基因NYD-SP5是一条人-小鼠同源基因。结构域分析推测NYD-SP5蛋白是一种跨膜蛋白。本研究用免疫组化和原位杂交方法研究了基因NYD-SP5在小鼠睾丸组织中的表达及定位;并构建基因NYD-SP5具有发夹结构小干扰RNA(shRNA)表达质粒。为下一步建立基因NYD-SP5的转基因小鼠模型及研究该基因的功能奠定了基础。方法用原位杂交法研究小鼠睾丸组织中NYD-SP5 mRNA的表达及定位;用免疫组化法研究小鼠睾丸组织中NYD-SP5蛋白的表达及定位。构建基因NYD-SP5的4个pGPU6/GFP-shRNA载体。根据NYD-SP5 mRNA序列,设计有小发夹结构的4条寡核苷酸序列,克隆到空载体pGPU6/GFP中,构建重组质粒,提纯及鉴定重组质粒,同时设计构建分别针对人GAPDH干扰质粒作为阳性对照,不针对任何特异基因的质粒作为阴性对照。通过酶切鉴定和测序验证阳性克隆。结果原位杂交技术显示,在小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞细胞质中实验组有棕黄色的染色,对照组未见棕黄色染色,说明NYD-SP5 mRNA存在于小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞中。免疫组织化学分析发现,在小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞胞质及管腔纤毛中,实验组有棕黄色染色,对照组未见棕黄色染色,说明NYD-SP5蛋白主要存在于小鼠睾丸生精小管上皮的生精细胞及管腔纤毛中。酶切电泳分析以及插入基因的序列分析证实,我们设计的碱基序列成功插入到了预计位点。经重组质粒筛选,重组质粒测序鉴定与设计的shRNA转录模板序列相同,均证实重组质粒构建成功。结论小鼠睾丸生精细胞中存在NYD-SP5 mRNA和蛋白表达,提示该基因可能对精子的发生发挥作用。利用RNA干扰技术路线可成功构建靶向NYD-SP5的发夹结构小干扰RNA表达载体。本研究为下一步建立基因NYD-SP5的转基因小鼠模型及研究该基因的功能奠定了基础。