论文部分内容阅读
肥胖是指人体脂肪的过量储存，表现为脂肪细胞体积增大和数目增多。其中，脂肪细胞数目增多是由于脂肪组织中多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的增多，后者在一定环境因素的作用下分化为成熟的脂肪细胞。从多潜能干细胞发育为成熟脂肪细胞需要经历一系列精确调控的级联过程，主要可以被划分为两个阶段:多潜能干细胞定向为前脂肪细胞;前脂肪细胞终末分化为成熟的脂肪细胞。之前的研究主要集中于从前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的过程，对于多潜能干细胞定向前脂肪细胞涉及的机制知之甚少。 本实验室以前的研究表明BMP4能促使C3H10T1/2多潜能干细胞定向为前脂肪细胞，Huang等发现BMP4是通过Smad及p38 MAPK两条信号通路发挥作用。不过这些调控因子和机制仅局限在蛋白水平上，在本课题中，我们将目光转向了microRNA领域，并确定了miR-140作为BMP4直接调控的miRNA能够通过直接抑制Ostm1的表达水平协助多潜能干细胞向前脂肪细胞定向，弥补该部分研究的空白。 我们在实验中发现，BMP4促使C3H10T1/2多潜能干细胞定向为前脂肪细胞的过程中引起了一系列microRNA表达变化。芯片结果显示有35种miRNA的变化有统计学差异，其中有15种miRNA表达上升，另外20种表达下降。而miR-140和miR-140*由于在定向过程中表达量明显上调且来自同一条miRNA前体吸引了我们的注意力。 为了进一步研究miR-140和miR-140*在多潜能干细胞定向前脂肪细胞过程中的作用机制，我们观察了C3H10T1/2细胞过表达特定miRNA对多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的影响。我们设计了miR-140和miR-140*的逆转录病毒表达载体，并感染C3H10T1/2细胞。结果表明与对照组相比，miR-140和miR-140*过表达的C3H10T1/2细胞，在缺乏BMP4处理的情况下也能部分定向为前脂肪细胞，而加入BMP4能使其定向更加彻底。接着，我们使用miR-140-sponge抑制miR-140发挥作用，发现miR-140-sponge能明显抑制BMP4和miR-140引起的定向。据此，我们认为miR-140在BMP4诱导的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中发挥了关键作用。 miRNA发挥功能主要是通过对靶基因进行直接的转录后调节。我们使用了三种靶标预测算法PicTar, TargetScan和Miranda，并选出在三种算法中都出现的mRNA。然后使用双荧光报告基因实验确定生物信息学预测结果。再从这一系列潜在的靶标中鉴别出在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程表达下调的蛋白。据此，我们确认了miR-140直接调控的靶蛋白Ostm1。 Ostm1全名为骨硬化相关跨膜蛋白1，位于细胞囊泡内。已报道的文章显示其主要具备三种生物学功能:1）作为氯离子通道蛋白7(ClC-7)的β亚基协助发挥破骨和溶酶体作用;2）作为一种泛素连接酶E3引发Gαi3降解;3）促进β-catenin与Left结合起始下游基因转录。 我们发现在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中， BMP4能够显著地抑制Ostm1的水平，而对照组蛋白则维持在一个较高的水平。C3H10T1/2多潜能干细胞定向过程中，BMP主要激活两条重要的信号通路，Smad和p38 MAPK信号通路。我们利用RNA干扰手段下调了Smad4或p38 MAPK的蛋白水平，从而达到阻断BMP信号通路的目的。结果显示下调Smad4或p38的蛋白水平能明显抑制miR-140和miR-140*的表达。同时，我们发现阻断BMP信号通路后，Ostm1的蛋白水平随之恢复了。说明BMP4的确通过上调表达miR-140以降低Ostm1的表达水平。 为了进一步明确Ostm1在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程中的作用，我们构建了Ostm1的逆转录病毒表达载体感染C3H10T1/2细胞，从而达到过表达Ostm1的目的。结果显示，Ostm1过表达显著地抑制多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。随后我们合成了Ostm1的siRNA，结果显示Ostm1下调以后多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的能力增强了，1/2剂量的BMP4即可以诱导70％以上的C3H10T1/2定向为前脂肪细胞并在MDI处理后最终分化为成熟的脂肪细胞，而对照组siRNA处理后仅有不到10％的细胞分化。这一系列结果说明Ostm1在前脂肪细胞定向过程中扮演了一个负向的调控作用。 综上所述，我们认为BMP4促进多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的过程中通过上调miR-140以抑制Ostm1的表达实现细胞的定向。至于Ostm1抑制定向的具体作用机制以及miRNA是否还有其他的靶基因则有待以后的实验进一步研究说明。