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近年来,由于湖泊富营养化日益严重,蓝藻大量繁殖引起水华事件频繁发生,这已成为全世界突出的环境问题之一,特别是在中国。因此探索和开发治理和预防水华的有效方法具有非常重要的现实意义。蓝藻是原核单细胞生物,是地球上最古老的光合自养生物,含有叶绿素a,可以进行光合作用。果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(FBP/SBPase)是其光合作用过程中重要的调控酶,是可能作为杀藻剂研究的潜在靶标酶。因此本文以蓝藻光合作用过程中重要的调控酶FBP/SBPase为靶标,研究活性中心重要氨基酸并进行了初步的杀藻抑制剂筛选,为探索和研究治理蓝藻水华的有效方法,寻求一种高效绿色除藻剂奠定基础。具体内容如下:
(1)结合文献和同源模建的结果,对蓝藻FBP/SBPase模建结构活性空腔中的K29、D33、E57、D97、E100、T102、Y131、R176、R178、D198、D200、E225、D247等13个氨基酸进行了突变,并成功获得其突变体。
(2)对突变体进行了活性测试,结果表明突变体的活性均显著降低,说明这些氨基酸均是重要氨基酸,对底物的结合和催化起重要作用,同时也说明模建结构较合理,为虚拟筛选奠定了基础。测定了Y131A、D198H的酶动力学参数,数据说明Y131与底物结合有密切关系,也影响Mg2+的结合,但Y131A的Mg2+协同效应未变;而D198可能对底物结合的贡献不大,而对Mg2+结合有重要作用,D198突变为H后改变了Mg2+协同效应。
(3)对实验室保存的天然化合物和R系列化合物进行了酶水平筛选,筛选到4个抑制效果较好的化合物,LMS-1和LMS-3a的IC50分别为107.7μM、125.4μM,R37和R45的IC50分别为77.7μM、86.5μM。
(4)对本课题组前期研究中已得到的酶体水平上抑制效果较好的化合物进行了藻体水平筛选,筛选到了5个EC50在35ppm以下的化合物,其中效果较好的是D7S15,对铜绿微囊藻912和PCC6803的EC50分别为4.3ppm、2.9ppm。同时还对27种农药进行了藻体水平筛选,得到嘧霉胺、苯醚甲环唑和强力胺菊酯原油三种农药对铜绿微囊藻912抑制效果较好,EC50分别是20.2ppm、11.3ppm、5.2ppm。