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花生是我国重要的油料作物,花生富含优质蛋白和脂肪,其中花生仁中含脂肪50％左右,其中大约80％由油酸和亚油酸组成,油酸具有降低人体低密度脂蛋白含量,减少胆固醇形成,减少氧化和酸败而使菜油的货架期延长等作用,因此提高花生品种油酸含量已成为目前和未来一段时期花生品质改良育种的研究热点。但是由于目前对花生油酸形成的分子机制及控制高油酸性状相关基因和蛋白质尚未清晰,以至高油酸品种选育周期长,成效低。本研究以从美国引进一个高油酸花生种质Sunoleic为材料,通过构建其荚果全长cDNA文库,对油酸合成代谢相关基因进行筛选分析,并通过比较与低油酸品种荚果发育过程基因和蛋白质表达差异,了解花生品种高油酸合成和积累机制,挖掘与高油酸含量相关的基因或蛋白,为下一步高油酸品种打下理论基础。而且对花生中油酸代谢分子机理的研究对培育高油酸含量的优质花生品种具有重要价值。本论文研究结果表明:
1.以高油酸花生品种Sunoleic荚果为材料,构建了高油酸花生品种Sunoleic荚果全长cDNA文库。经检测滴度大于1.5×104/μl,插入片断大于400bp,平均插入片断在1Kb左右。取平均片段大于600bp的PCR检测后的单克隆菌进行5’序列测定。获得9364个cDNA序列,其中有效序列8725个,拼接序列845个,单一序列2259个,一致序列3104个,冗余序列为64％。
2.对3104条一致序列与GenBank数据库进行Blastx分析,596条与17类功能已知基因同源性相关；1938条EST序列属于功能未知基因片段；其余570条EST序列在GenBank中未检索到任何同源序列。
3.用EST测序获得的9364个cDNA序列与本实验室已构建的花生品种粤油20(低油酸含量品种)和TIFRUNNER(低油酸含量品种)cDNA文库中的21777个有效测序EST进行聚类分析,找出三个品种中碱基匹配一致且R>8(丰度值即EST文库拷贝数)的序列90个,其中9条EST在粤油20上调表达,tif不表达,Sunolcic下调表达；8条EST仅在tif高表达,粤油20,Sunoleic均下调表达；15条EST在粤油20,tif上调表达,Sunoleic则下调表达；58条EST仅在Sunoleic中上调表达。
4.以3104条一致序列与the Arabidopsis Lipid Gene Database(http://lipids.plantbiology.msu.edu/index.htm?q=lipids/genesurvey/index.htm)比较筛选与植物脂肪酸合成途径中相关的候选基因214个,用于膜杂交筛选。通过膜杂交技术对214个候选基因在不同油酸含量花生品种荚果五个不同发育时期进行基因的表达差异分析,初步筛选出28个在高油酸品种Sunoleic中上调表达的基因,其中上调量最大的8个基因已经通过QRT-PCR的初步验证,结果表明这些基因跟油酸的生物合成代谢有关。
5.采用双向电泳技术,通过对三个不同油酸含量花生品种荚果五个不同发育时期实验材料的蛋白进行2D分析,结果表明不同油酸含量花生的蛋白表达存在很大差异,通过比较分析找到70个仅在高油酸品种中显著上调的差异蛋白。这些特异表达蛋白序列分析还在进行当中。