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山萘酚作为自然界中常见的天然活性成分，其广泛的药理作用具有制剂开发和临床应用的价值，在治疗各种疾病方面拥有一定的前景。在治疗肿瘤方面，山萘酚诱导凋亡，阻滞细胞周期等抗癌机制已被广泛报道，但由于山萘酚水溶性差，体内生物利用度低严重影响了其开发与应用的进程。脂质体作为生物相容性良好的纳米药物载体，可用于负载山萘酚并提高其水溶性和稳定性以解决溶解性的难题。此外，采用两亲性靶向聚合物DSPE-PEG2000-cRGD修饰山萘酚脂质体，通过靶向配体cRGD与肿瘤细胞表面过表达的整联蛋白之间的特异性结合来实现癌细胞靶向，可以提高山萘酚的抗肿瘤疗效。因此，本课题制备了负载山萘酚的肿瘤靶向脂质体，考察了该脂质体的形貌、粒径、载药量、包封率、释药性能、稳定性以及安全性等，并对其抗卵巢癌活性及机制作初步探讨。
主要内容如下：
第一章，建立山萘酚检测分析方法。并考察山萘酚在PBS溶液中的溶解度无法达到检测标准，属于难溶性物质，而加入2%Tween-80的PBS中山萘酚的溶解度显著提高至121.72μg/mL，因此作为后续体外药物释放的释药介质。通过加成反应制备了靶向聚合物DSPE-PEG2000-cRGD，并利用核磁共振氢谱和红外光谱对其结构进行表征，最后通过荧光显微镜和流式细胞术筛选该靶向聚合物的比例，发现DSPE-PEG2000-cRGD与磷脂的最佳比例为1∶31。以包封率与载药量作为指标，通过单因素考察与正交实验优选，得到磷脂、胆固醇、药物的摩尔比120∶7.5∶6为最优处方比例，制备过程中最佳水化温度为35℃，超声时间为8min。
第二章，采用薄膜水化法结合微孔滤膜法制备得到山萘酚脂质体(LP@KAE)和靶向山萘酚脂质体(cRGD-LP@KAE)，对两者进行宏观与微观的形貌观察。用肉眼观察时，可见两种脂质体溶液均为有淡蓝色乳光的溶液，用激光笔照射溶液时，与光线垂直的方向可以观察到丁达尔效应。用电镜观察发现，两种脂质体均为粒径均匀分布的类球形结构。LP@KAE与cRGD-LP@KAE脂质体在水溶液中的粒径分别为141.57±0.70nm、129.43±2.83nm，其粒径分别PDI分别为0.240±0.002、0.258±0.001，zeta电位分别为-43.77±0.72mV、-34.27±0.90mV，载药量分别为1.68±0.07%、1.67±0.01%，包封率分别为97.88±0.25%、98.09±0.30%。分别考察游离KAE和两种脂质体制剂的体外药物释放行为，发现LP@KAE与cRGD-LP@KAE具有明显的缓释行为，对释药曲线进行不同数学模型的拟合，发现游离KAE较为符合Weibull方程，LP@KAE与cRGD-LP@KAE分别符合一级动力学方程与Ritger-pappas方程，且它们的释药行为有显著性差异。为了提高脂质体在冷冻干燥过程中和再水化后的稳定性，我们以脂质体复溶后的粒径、PDI及包封率作为指标，考察了蔗糖、海藻糖及甘露醇等冻干保护剂的效果。结果发现相比于海藻糖及甘露醇，蔗糖具有更好的冻干保护效果，且其用量为磷脂质量的4倍时效果最佳。以粒径与包封率作为指标考察脂质体的稳定性，发现cRGD-LP@KAE在4℃低温储存15天后表现出良好的稳定性，而LP@KAE的包封率则有所下降。最后以溶血率作为评价空白脂质体和载药脂质体生物安全性的指标，发现空白的普通脂质体和靶向脂质体的溶血率均低于2%，相应的载药脂质体LP@KAE与cRGD-LP@KAE的溶血率也均低于2%，证明本文中的四种脂质体血液相容性良好，是安全的药物载体或制剂。
第三章，以卵巢癌A2780细胞作为实验模型，考察了游离KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE的体外抗肿瘤疗效。通过MTT法检测，KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE对A2780细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为24.55μg/mL、18.93μg/mL与11.95μg/mL，表明脂质体可以提高山萘酚的抗肿瘤疗效，且靶向脂质体制剂cRGD-LP@KAE的疗效最佳。采用香豆素6作为荧光指示剂，分别用荧光显微镜和流式细胞术检测卵巢癌A2780细胞对普通脂质体LP@C6与靶向脂质体cRGD-LP@C6的摄取。结果表明cRGD-LP@C6进入A2780细胞量更多。为验证该摄取行为的确是由cRGD引起，用cRGD预处理A2780细胞后，再加入cRGD-LP@C6，发现细胞摄取量明显减少，证明cRGD与细胞膜表面过表达的整联蛋白之间的特异性识别，是提高A2780细胞对cRGD-LP@C6摄取的主要原因。最后考察了游离KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE对细胞凋亡率和细胞周期的影响。通过流式细胞术检测，发现经过游离药物和两种脂质体制剂处理后，A2780细胞的总凋亡率分别是10.41%、31.39%、61.17%，表明靶向制剂诱导细胞凋亡的作用最强。在细胞周期检测中，发现山萘酚可以明显诱导G2/M期阻滞，三种细胞的G2/M期比例分别为26.44%、30.44%、40.46%，结果表明cRGD-LP@KAE在细胞周期阻滞中具有最佳效果。
本文制备得到的cRGD-LP@KAE脂质体能够显著提升山萘酚的水溶性，且具有良好的生物安全性与稳定性。和游离山萘酚、LP@KAE脂质体相比，该脂质体能提高卵巢癌细胞对山萘酚的摄取量，并显著提高山萘酚的抗肿瘤疗效，为山萘酚新制剂的研发提供实验依据和新思路。
主要内容如下：
第一章，建立山萘酚检测分析方法。并考察山萘酚在PBS溶液中的溶解度无法达到检测标准，属于难溶性物质，而加入2%Tween-80的PBS中山萘酚的溶解度显著提高至121.72μg/mL，因此作为后续体外药物释放的释药介质。通过加成反应制备了靶向聚合物DSPE-PEG2000-cRGD，并利用核磁共振氢谱和红外光谱对其结构进行表征，最后通过荧光显微镜和流式细胞术筛选该靶向聚合物的比例，发现DSPE-PEG2000-cRGD与磷脂的最佳比例为1∶31。以包封率与载药量作为指标，通过单因素考察与正交实验优选，得到磷脂、胆固醇、药物的摩尔比120∶7.5∶6为最优处方比例，制备过程中最佳水化温度为35℃，超声时间为8min。
第二章，采用薄膜水化法结合微孔滤膜法制备得到山萘酚脂质体(LP@KAE)和靶向山萘酚脂质体(cRGD-LP@KAE)，对两者进行宏观与微观的形貌观察。用肉眼观察时，可见两种脂质体溶液均为有淡蓝色乳光的溶液，用激光笔照射溶液时，与光线垂直的方向可以观察到丁达尔效应。用电镜观察发现，两种脂质体均为粒径均匀分布的类球形结构。LP@KAE与cRGD-LP@KAE脂质体在水溶液中的粒径分别为141.57±0.70nm、129.43±2.83nm，其粒径分别PDI分别为0.240±0.002、0.258±0.001，zeta电位分别为-43.77±0.72mV、-34.27±0.90mV，载药量分别为1.68±0.07%、1.67±0.01%，包封率分别为97.88±0.25%、98.09±0.30%。分别考察游离KAE和两种脂质体制剂的体外药物释放行为，发现LP@KAE与cRGD-LP@KAE具有明显的缓释行为，对释药曲线进行不同数学模型的拟合，发现游离KAE较为符合Weibull方程，LP@KAE与cRGD-LP@KAE分别符合一级动力学方程与Ritger-pappas方程，且它们的释药行为有显著性差异。为了提高脂质体在冷冻干燥过程中和再水化后的稳定性，我们以脂质体复溶后的粒径、PDI及包封率作为指标，考察了蔗糖、海藻糖及甘露醇等冻干保护剂的效果。结果发现相比于海藻糖及甘露醇，蔗糖具有更好的冻干保护效果，且其用量为磷脂质量的4倍时效果最佳。以粒径与包封率作为指标考察脂质体的稳定性，发现cRGD-LP@KAE在4℃低温储存15天后表现出良好的稳定性，而LP@KAE的包封率则有所下降。最后以溶血率作为评价空白脂质体和载药脂质体生物安全性的指标，发现空白的普通脂质体和靶向脂质体的溶血率均低于2%，相应的载药脂质体LP@KAE与cRGD-LP@KAE的溶血率也均低于2%，证明本文中的四种脂质体血液相容性良好，是安全的药物载体或制剂。
第三章，以卵巢癌A2780细胞作为实验模型，考察了游离KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE的体外抗肿瘤疗效。通过MTT法检测，KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE对A2780细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为24.55μg/mL、18.93μg/mL与11.95μg/mL，表明脂质体可以提高山萘酚的抗肿瘤疗效，且靶向脂质体制剂cRGD-LP@KAE的疗效最佳。采用香豆素6作为荧光指示剂，分别用荧光显微镜和流式细胞术检测卵巢癌A2780细胞对普通脂质体LP@C6与靶向脂质体cRGD-LP@C6的摄取。结果表明cRGD-LP@C6进入A2780细胞量更多。为验证该摄取行为的确是由cRGD引起，用cRGD预处理A2780细胞后，再加入cRGD-LP@C6，发现细胞摄取量明显减少，证明cRGD与细胞膜表面过表达的整联蛋白之间的特异性识别，是提高A2780细胞对cRGD-LP@C6摄取的主要原因。最后考察了游离KAE、LP@KAE与cRGD-LP@KAE对细胞凋亡率和细胞周期的影响。通过流式细胞术检测，发现经过游离药物和两种脂质体制剂处理后，A2780细胞的总凋亡率分别是10.41%、31.39%、61.17%，表明靶向制剂诱导细胞凋亡的作用最强。在细胞周期检测中，发现山萘酚可以明显诱导G2/M期阻滞，三种细胞的G2/M期比例分别为26.44%、30.44%、40.46%，结果表明cRGD-LP@KAE在细胞周期阻滞中具有最佳效果。
本文制备得到的cRGD-LP@KAE脂质体能够显著提升山萘酚的水溶性，且具有良好的生物安全性与稳定性。和游离山萘酚、LP@KAE脂质体相比，该脂质体能提高卵巢癌细胞对山萘酚的摄取量，并显著提高山萘酚的抗肿瘤疗效，为山萘酚新制剂的研发提供实验依据和新思路。