论文部分内容阅读
血管生成与肿瘤的复发转移密切相关，抗肿瘤血管生成被认为是肿瘤治疗的一种有效手段。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial grow factor，VEGF）及其受体VEGFRs在血管生成中发挥关键作用，而VEGFR2转导血管生成的主要信号，因而VEGFR2本身及其信号通路被认为抗肿瘤血管生成的理想靶点。之前的研究表明，基于VEGFR2胞外段的不同类型疫苗可以单独诱发针对肿瘤血管内皮细胞的细胞免疫和体液免疫，提示VEGFR2胞外段同时存在体液免疫和细胞免疫的识别位点，为进一步设计疫苗同时诱发细胞及体液免疫提供了基础。本研究中我们设计了一个小鼠防御素-beta2（murine beta defensin2，MBD2）与小鼠VEGFR（mFlk-1）的融合疫苗pSecTag-MBD2-mFlk-1，利用MBD2的趋化活性及诱导幼稚树突状细胞（Immature dentritic cells，iDCs）成熟作用，将mFlk-1靶向到抗原呈递细胞（Antigen presenting cells，APCs），特别是DCs，并利用APCs的CCR6以及TLR4受体的内在化作用，将mFlk-1内吞后加工呈递，进而诱发针对肿瘤血管内皮细胞主动免疫。研究结果表明，MBD2通过一段连接肽序列融合到mFlk-1后，融合基因能够表达，并保留了MBD2的活性，能够有效趋化iDCs。融合的DNA疫苗免疫BALB／c及C57BL／6小鼠后，小鼠接受结肠癌细胞株CT26及小鼠肺癌细胞株LL／2挑战，融合基因免疫组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，这一免疫作用被血清及CTL过继免疫所证实。在末次免疫接种后6个月，我们仍然检测到有效的免疫反应。我们检测了诱导的免疫反应对新生血管生成的抑制作用，对冰冻切片的CD31的染色表明，来源于融合疫苗pSecTag-MBD2-mFlk-1免疫组小鼠的肿瘤的微血管密度较对照组明显下降，而藻酸盐实验也证实了这一结果，融合疫苗pSecTag-MBD2-mFlk-1免疫组小鼠包埋的藻酸盐珠出现了更少的新生血管。接着我们探讨了pSecTag-MBD2-mFlk-1是否同时了诱导体液免疫及细胞免疫，western-blot检测到pSecTag-MBD2-mFlk-1免疫组小鼠血清中抗体的存在，而mFlk-1免疫组仅仅检测到微量反应，51Cr释放实验检测了CTL活性，pSecTag-MBD2-mFlk-1免疫组来源的CTL对小鼠血管内皮细胞株显示出特异的杀伤活性。我们进一步采用CD4、CD8及NK单抗进行了免疫阻断实验，同时也采用了CD4-／-、CD8-／-、CD1-／-、Ig H-／-敲除小鼠来进行pSecTag-MBD2-mFlk-1免疫并接受肿瘤挑战，结果表明，pSecTag-MBD2-mFlk-1诱导的体液及细胞免疫反应都依赖于CD4+亚群TL，CD8+单抗阻断和CD8、IgH敲除都削弱了pSecTag-MBD2-mFlk-1的免疫反应，而与NK单抗和CD1敲除无关。我们的研究结果表明，MBD2与mFlk-1的融合疫苗pSecTag-MBD2-mFlk-1能够有效打破机体对mFlk-1的免疫耐受，诱发机体产生针对血管内皮细胞的细胞及体液免疫反应，并产生免疫记忆，同时，基于之前的研究，我们的研究也进一步提示，打破同一个抗原的免疫耐受并诱发不同的免疫反应，可能取决于不同的抗原呈递方式。