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肝癌是我国常见的恶性肿瘤,从二十世纪末开始已在我国恶性肿瘤死亡原因中居第二位,其年死亡率为20.40/10万。近年来,随着B超、CT和MR等影像技术的发展以及甲胎蛋白(AFP)检测技术的普遍应用,肝癌的诊断水平有了很大的提高。治疗手段也日趋多样化并形成了以手术为主的综合治疗方案,然而,多发病灶和肝内转移是肝癌极其常见的现象,手术治疗时常难以彻底切除肿瘤组织,难以达到根治的目的。还有一些病灶由于其大小或所处位置而不适合手术。同时放、化疗的敏感性较低,毒副作用又常常对患者造成严重的损害,使患者的生存质量下降,甚至威胁到生命,而且肿瘤细胞的耐药性也是影响疗效不可忽视的因素。可见传统的治疗方法存在明显的局限性。主要原因是肝癌术后复发率很高,大肝癌根治性切除术后5年复发率约为80%,小肝癌亦达60%左右。目前缺乏有效的抗复发措施,因此,研究发现新的肝癌术后抗复发措施对于提高肝癌治疗水平具有重要意义。肿瘤免疫治疗研究是倍受关注的研究课题,既往曾有大量应用非特异性免疫刺激物质,细胞因子(IL-2,INF-γ),LAK及TIL临床应用的报道,但总体效果远不理想。上述治疗仅能在一定程度上提高机体的非特异性免疫功能,缺乏对肿瘤的特异杀伤机制的有效诱导。诱导机体特异性抗肿瘤免疫反应是近年研究的热点。细胞免疫在特异性抗肿瘤免疫反应中发挥主要作用,其中激活T细胞是重要的效应细胞,获得大量激活T细胞是免疫治疗的关键。既往研究中,我们依据T细胞激活的多信号刺激原理,建立体外诱导肝癌细胞毒T淋巴细胞(CTL)方法,既取手术切除的肝癌标本,分离肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),在体外将肿瘤细胞与浸润淋巴细胞混合培养,加抗CD28共刺激分子的交联作用,有效激活T细胞,虽然体内外均证实了较现有非特异性抗肿瘤作用存在优越性,但仍存在体外难获得大量激活T细胞和培养时间太长的问题,而且有部分标本体外激活培养常常失败。即使培养成功,临床也只有少部分患者有明显疗效。上述问题是我们在此课题中要解决和回答的问题,有关Fas-FasL在肿瘤免疫作用的研究,加深了对这些问题的认识。Fas为Ⅰ型膜蛋白。属TNF/NGF受体家族成员,人淋巴细胞表达Fas。现已证<WP=8>实,当淋巴细胞激活时,Fas表达增加,对Fas介导的细胞凋亡敏感性增加。Fas配体(FasL)在正常淋巴细胞不表达,只有当淋巴细胞激活后FasL表达。Fas-FasL结合后,可通过Fas受体胞内区的死亡结构域(DD)向细胞传达凋亡信号,诱导表达Fas受体细胞凋亡,因此当激活T细胞混合在一起时可诱导激活T细胞凋亡。这在正常机体作为机体免疫功能调节机制之一,防止免疫反应过强。而在体外激活T细胞培养时,大量激活T细胞混在培养瓶内,激活T细胞间可诱导自身凋亡,影响大量获得有效激活T细胞。我们设想加入可溶性Fas受体,封闭激活T细胞表达的FasL,使之不能与激活的T细胞膜表面的Fas受体结合,达到阻断激活T细胞凋亡的目的,从而获得大量激活T细胞用于肝癌术后过继免疫治疗,同时可使培养时间缩短,达到术后早期免疫辅助治疗的目的。新近研究发现Fas-FasL系统在肿瘤逃脱机体免疫机制中发挥作用,部分肿瘤细胞表达FasL,使该肿瘤细胞对激活淋巴细胞有反攻击作用,从而达到逃脱机体免疫目的。肿瘤细胞表达FasL,当激活T细胞到肿瘤局部与肿瘤细胞接触,由于自身表达Fas,不但不能有效杀伤肿瘤细胞,反而肿瘤细胞表达FasL与之Fas结合,从而诱导其自身凋亡,这就是肿瘤细胞对免疫细胞的反攻击作用。研究证实部分肝脏的恶性肿瘤细胞表达FasL,存在对淋巴细胞的反攻击作用。当体外肝癌细胞与浸润淋巴细胞混合培养,共刺激使T淋巴细胞特异激活时,不但存在激活T细胞间诱导Fas介导T细胞凋亡,还存在表达FasL肝癌细胞对淋巴细胞的反攻击,这可能是部分标本培养失败的原因,因此我们设想在肝癌细胞与浸润淋巴细胞体外混合培养,联合共刺激分子激活过程中,加入可溶性Fas受体,不但能阻断激活T细胞间诱导凋亡,还能达到封闭表达FasL肝癌细胞对激活T细胞的反攻击作用。肿瘤细胞表达FasL对免疫细胞的反攻击作用不但在激活过程中可诱导激活T细胞凋亡,还可进一步影响激活T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。肿瘤细胞表达FasL,由于输入体外激活T细胞时,CTL不但不能有效杀伤肿瘤细胞,反而因表达FasL肿瘤细胞反攻击诱导T细胞凋亡,从而使肿瘤细胞逃脱激活T细胞杀伤。在T细胞杀伤前,用可溶性Fas封闭肝癌细胞表面FasL,阻断其对T细胞反攻击作用,使T细胞安全有效杀伤肿瘤细胞。预期研究结果可望为肝癌过继免疫治疗研究提供实验基础和新策略。本实验包括三个部分: <WP=9>第一部分 可溶性Fas 阻断T细胞表面Fas L 体外制备肝癌特异CTL:通过阻断介导T细胞凋亡,可望建立快速大量激活制备肿瘤特异性CTL方法,并提高抗肿瘤效果。实验结果发现,用肝癌手术切除标本制备肿瘤特异性CTL过程中,应用可溶性Fas 双重阻断激活T细胞间诱导T细胞凋亡和表达FasL的肿瘤细胞对免疫细胞反攻击诱导的T细胞凋亡。可望短时间获得大量肿瘤特异的激活T细胞。进一步观察阻断Fas介导T 细胞抗肿瘤免疫活性。观察肝细胞表面FasL被封闭后对CTL杀伤敏感性变化,可望为肿瘤免疫治疗研究提供新策略。既取肝癌手术切除标本,分离肝癌细胞和肿瘤浸润淋巴细胞