论文部分内容阅读
目的：
1、探讨STZ建立胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)大鼠模型的适合剂量。
2、探讨胰岛细胞分离、纯化及胰岛细胞活性鉴定的方法。
3、经门静脉胰岛细胞移植(PIT)后,探讨淋巴细胞相关功能抗原-1(LFA-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达与移植免疫排斥反应的关系,为胰岛细胞移植后排斥反应的临床治疗提供理论依据。
材料和方法：
1、建立大鼠糖尿病动物模型：
将72只wistar大鼠随机分为三组:A组(n=24),链脲佐菌素(STZ)腹腔内注射(55mg/Kg);B组(n=24),STZ腹腔内注射(65mg/Kg);C组(n=24),STZ腹腔内注射(75mg/Kg)。观察注射后静脉血血糖值、大鼠体重、饮水量、尿量及一般活动情况的变化,根据刘学政等成模标准[1]判断三组的成模率。
2、成年大鼠胰岛细胞提取、分离及纯化：
经胆总管内逆行灌注胶原酶V的方法消化胰岛组织,Ficoll 400非连续密度梯度离心纯化消化产物,获得胰岛细胞后双硫腙(DTZ)和吖啶橙-碘丙啶(AO-PI)双染色计算胰岛细胞数量,结合糖刺激胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞移植物的活力。
3、黏附分子的检测：
(1)实验动物分组：
40只Wistar糖尿病大鼠随机分为三组,A组：糖尿病模型组(n=10),不做任何处理；B组：生理盐水组(n=10),采用腹腔注射生理盐水2ml/d;C组：免疫抑制剂组(n=10),采用腹腔注射CSA(3mg/kg·d)+MMF(20mg/kg·d);D组：低分子肝素组(n=10,4mg/kg·d),采用皮下注射。
(2)胰岛细胞移植：
全部采取SD大鼠胰岛细胞→wistar大鼠糖尿病动物模型。
(3)观察各组胰岛细胞移植后第1、4、7、10、30、60天大鼠外周血血糖的变化,进而判断移植物存活时间。
(4)流式细胞仪(Elite Coultel Company US)技术检测胰岛细胞移植后外周血黏附分子ICAM-1、LFA-1的表达。
(5)免疫组化方法检测各组胰岛细胞移植后第10、60天,肝脏病理切片中黏附分子ICAM-1、LFA-1的表达。
结果：
1、A组成模率为8.33％,B组成模率为91.67％,C组成模率为91.67％,A组与B组比较有显著性差异(P<0.05),A组与C组比较有显著性差异(P<0.05),B组与C组无显著差异(P>0.05);B、C组与A组相比在注射STZ后血糖值升高明显、体重增加减缓或不增加、甚至下降,且一般情况均较差,饮水量明显增加；成模后2周A、B两组死亡率都为零,C组大鼠死亡6只,死亡率为25％且感染率高达50％。
2、本研究对24只SD大鼠胰腺进行消化、纯化后获得的胰岛细胞数为430-670个胰岛/胰腺,平均为520±70个胰岛/胰腺,活率在90％以上,纯度为85％以上,胰岛素释放试验显示大鼠胰岛细胞经高糖刺激后胰岛素分泌是低糖刺激分泌的2.8倍(P<0.05),表明胰岛细胞功能良好。
3、(1)胰岛细胞移植后血糖值变化情况：
术前各组间血糖值比较无统计学差异(P=0.669);血糖在术后第7或10天达最低水平,之后逐渐上升；C、D组各时间点均无统计学差异；除C组与D组比较(P=0.155)无统计学差异,其余任何两组间比较有统计学差异。
(2)胰岛细胞移植后外周血黏附分子的表达情况：
①术前各组间ICAM-1值比较无统计学差异(P=0.754);术后C、D组在第7或10天达最低水平,以后逐渐上升,最后接近B组水平；C、D组各时间点均无统计学差异；除C组与D组比较(P=0.155)无统计学差异,其余任何两组间比较有统计学差异。
②LFA-1的表达：术前各组间LFA-1值比较无统计学差异(P=0.215);术后C、D组在第7或10天达最低水平,以后逐渐上升,最后接近B组水平；C、D组各时间点均无统计学差异；除C组与D组比较(P=0.065)无统计学差异,其余任何两组间比较有统计学差异。
(3)肝脏黏附分子的表达情况(平均光密度法)：
①肝脏ICAM-1的表达：
术后10天和术后60天比较:A组(P=0.816)无统计学差异,B组(P=0.855)无统计学差异,C组(P=0.000)有统计学差异,D组(P=0.000)有统计学差异。术后10天:C组、D组之间无统计学差异,其余任何两组间均存在统计学差异(P<0.05)。
术后60天:B组与C组无统计学差异,B组与D组无统计学差异,C组与D组无统计学差异,A组同任何组均存在统计学差异(P<0.05)。
②肝脏LFA-1的表达：
术后10天和术后60天比较:A组(P=0.591)无统计学差异,B组(P=0.162)无统计学差异,C组(P=0.000)有统计学差异,D组(P=0.000)有统计学差异；
术后10天:C组、D组之间无统计学差异,其余任何两组间均存在统计学差异(P<0.05)。
术后60天:B组与C组无统计学差异,B组与D组无统计学差异,C组与D组无统计学差异,A组同任何组均存在统计学差异(P<0.05)。
结论：
1、STZ是目前建立胰岛素依赖型糖尿病大鼠动物模型的理想药物之一,应用65mg/Kg的剂量具有成模率高、死亡率低、感染率低等优点。
2、经胆总管逆行注入消化酶,Ficoll400不连续密度梯度离心是消化分离、纯化胰岛细胞有效的方法,而DTZ、AO-PI双色荧光染色及糖刺激胰岛素释放试验三者相结合鉴定胰岛细胞移植物质量既有效且可靠。
3、(1)PIT后粘附分子的变化与免疫排斥反应的发生有很大的相关性,进而和移植物功能有一定的相关性；(2)PIT后粘附分子表达水平的升高可以预示免疫排斥反应的发生；(3)PIT后低分子肝素的应用,可以在一定程度上延长移植物存活时间。