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重金属镉是一种非必需元素，对植物体具有很强的毒害作用。NO作为一种重要的信号分子，现已证明其在植物对重金属胁迫(如镉、砷和铜等)响应过程中发挥重要的作用。然而，目前关于NO参与植物对镉胁迫响应过程的研究大多集中在植物整株或组织水平上，关于NO在镉胁迫对植物细胞毒害过程中的作用机理仍所知甚少。本研究选用烟草BY-2细胞系作为实验材料，设计和开展了一系列实验以探讨NO在镉胁迫诱导BY-2细胞凋亡过程中的作用及调控机理，以期为植物修复技术提供更加深入的理论基础。
采用150μMCdCl2对烟草BY-2细胞进行胁迫处理。Hoechst33342-PI双染法检测表明镉胁迫可诱导BY-2细胞发生明显的核染色质浓缩现象；TUNEL检测结果呈阳性，显示镉胁迫可导致细胞基因组DNA断裂；RT-PCR结果表明镉胁迫可明显诱导细胞凋亡发生相关基因Hsr203J表达增加；caspase3-like蛋白酶活性检测结果表明，与对照相比，镉胁迫处理可显著激活caspase3-like蛋白酶的活性。以上结果从不同水平提示重金属镉(150μMCdCl2)对植物细胞的毒害诱发细胞凋亡的发生。
采用NO特异荧光探针DAF-FMDA检测镉胁迫处理后BY-2细胞内NO含量变化，结果显示镉胁迫下NO含量明显增加；血红蛋白法测定NO含量的结果同样表明镉胁迫可诱导胞内NO产生。选用NO相关试剂如NO合酶抑制剂L-NAME、清除剂cPTIO和NO供体SNP进行处理，在荧光显微镜下观测BY-2细胞的凋亡情况并进行统计分析，结果表明清除或抑制NO可明显缓解镉胁迫诱导产生的细胞凋亡；而外源添加NO可显著加重该凋亡过程。上述结果暗示NO参与了镉胁迫诱导的BY-2细胞凋亡过程并起到加速凋亡的作用。
采用ICP-ES测定胞内镉含量，结果显示外施L-NAME能够降低BY-2细胞内镉含量，外源添加NO后胞内镉积累明显增加。利用非损伤微测技术(SIET)测定结果表明，外施NO可显著促进胞外镉离子的内流速率，而添加L-NAME可显著降低镉离子内流，特别是外施cPTIO后可使胞外镉离子流由内流变为外排。这些结果暗示，NO具有调控镉离子吸收进而促进胞内镉离子积累的作用。此外，SIET检测数据显示随着镉处理时间的延长，胞外镉离子内流速率显著降低，这一结果作为直观证据首次证实植物细胞吸收镉离子的速率并非固定不变，暗示植物细胞在遭受镉胁迫后会启动某些抵御机制阻止镉离子进入细胞。
对内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ER stress)反应标志蛋白BIP进行的Western blotting结果显示，镉处理可引起胞内BIP蛋白在翻译水平表达的明显增加；进一步以Hoechst33342-PI双染法检测凋亡情况，结果表明内质网应激反应缓解剂TUDCA和4-PBA均可显著缓解镉胁迫诱导产生的细胞凋亡，暗示内质网应激信号途径参与了镉处理引起的BY-2细胞凋亡过程。Western blotting结果还显示，与单加镉离子处理相比，NO供给能够促进镉处理条件下细胞内的BIP表达水平的进一步提高。凋亡检测显示外施NO可加重内质网应激反应诱导剂TM诱导产生的细胞凋亡过程。由此推测NO可能直接参与内质网应激信号途径引发的细胞凋亡的调控。
无论外源添加NO或抑制NO含量，镉含量测定结果显示，TUDCA均能促进镉含量增加。这表明在镉胁迫诱导BY-2细胞凋亡过程中内质网应激途径具有非常重要的地位，且内质网应激途径介导的细胞凋亡过程可能并不完全仅受NO这一种信号分子的调控。
对活性氧物质超氧阴离子和过氧化氢分别进行荧光检测和含量测定，结果表明镉处理可诱导BY-2细胞产生氧化胁迫。利用NO供体SNP和NO合酶抑制剂L-NAME进行分析发现NO可促进超氧阴离子产生和过氧化氢含量增加，暗示NO参与调控镉诱导活性氧物质的产生并起到加重氧化胁迫的作用，这可能也是NO能够加重镉诱导细胞凋亡的原因之一。
此外，本论文对一种新型的镉离子比例荧光探针进行了植物体内镉离子标记和应用分析。采用荧光分光光度计和激光共聚焦显微镜进行体外溶液检测，结果显示该探针在结合镉离子前后发射光发生30-40nm的蓝移。激光共聚焦显微镜下对镉超富集植物伴矿景天和烟草BY-2细胞内的荧光进行观测及光谱分析，结果显示，该探针在结合镉离子前后荧光明显增加且发射峰均出现10nm至25nm不等的蓝移。以上结果表明该镉探针可用于植物体内镉离子标记。荧光定位分析表明在伴矿景天中镉离子主要分布在根、茎、叶的表面及某些区域如木质部导管区域、叶的脉管附近；在BY-2原生质体和细胞内主要集中在细胞膜、细胞壁、部分细胞质和细胞核周边区域。
综上所述，重金属镉对植物细胞的毒害可诱发细胞凋亡的发生。在此过程中，细胞产生NO，且NO能够加速细胞凋亡，其机制一定程度上在于NO可促进镉离子内流进而造成胞内镉离子积累。进一步研究表明，内质网应激信号和ROS均可介导镉诱导细胞凋亡的过程，而NO可能参与并调控了这两种信号途径。