重组毕赤酵母生产人生长激素的发酵条件研究

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本研究首次采用基因工程菌重组毕赤酵母表达人生长激素(human growthhormone,hGH),通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化;对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化;根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵;对表达产物进行了初步鉴定。实验结果如下:1.以BSM培养基为发酵培养基并对其进行改良:对基本碳、氮源进行了选择并对实验数据进行了分析处理,结果显示分别以甘油、葡萄糖作为碳源时,甘油优于葡萄糖;以酵母粉、(NH42SO4?作为氮源时,酵母粉远优于(NH42SO4;对甘油、酵母粉、磷酸盐缓冲液、MgSO4·7H2O等进行了单因素分析后做正交试验,得到了改良BSM培养基的最佳配比为:甘油30g/L、酵母粉14g/L、K2SO4 12g/L、MgSO4·7H2O 13g/L、CaSO4 0.3 g/L、PTM1 4.4 mL,0.1mol/L磷酸盐缓冲液50mL(pH=6.6)。2.考察了影响外源蛋白表达的因素,包括接种量、种龄、诱导时间、甲醇浓度、pH等,得到最佳培养及诱导条件为:接种量为8%,最佳种龄为24h,诱导时间为30h,甲醇浓度为2%,pH为6.3~6.9。3.对摇瓶实验结果进行了放大,用瑞士Bioen百neering公司L1523型12.8L发酵罐进行了补料-分批发酵,方法为:当甘油耗尽(表征为DO陡然上升)时,开始补加50%甘油(含12mL/LPTM1),并间歇补加酵母液,控制流加速度维持DO在30%~40%,当发酵液的OD600值达到300左右时,开始以3 mL/(L·h)的速率加入甲醇(含12mL/L PTM1)诱导,而甘油补加速率由13.3 mL/(L·h)逐渐降低至O0mL/(L-h),甲醇补加速率由3 mL/(L-h)逐渐升高到10 mL/(L·h),该过度阶段约维持4~6h,此后甲醇补加速率根据溶氧变化及尾气分析仪在线检测到的CO2的变化情况及时调整。发酵结束后,细胞光密度(OD600)达到350,rHGH表达量最高达到0.54g/L。4.通过SDS-PAGE凝胶电泳法对表达产物进行了定性分析,结果表明表达产物与rhGH标准品具有相同的相对分子量,初步表明该产物即为人生长激素。
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