花生转录因子AhAREB1调控AhNCED1表达研究

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liongliong585
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AREB是一类重要的植物bZIP转录因子,能特异识别基因启动子上的ABRE顺式元件,在ABA依赖型胁迫应答途径中发挥作用。前期研究表明,ABA合成关键酶NCED的基因上存在ABRE顺式元件,能够被AREB识别并结合,这为ABA合成过程中的反馈调节提供了证据。本论文以转基因拟南芥pAhNCED1∷GUS/columbia(CK)为受体材料,再转入花生基因AhAREB1-GFP全长及三个缺失保守结构域片段△C1-AhAREB1-GFP、△C2-AhAREB1-GFP、△C3-AhAREB1-GFP,旨在认识AhAREB1调控AhNCED1的表达及该过程中的AhAREB1蛋白必需和非必需基序。实验取得以下结果:  1、拟南芥p35S∷AhAREB1-GFP/pAhNCED1∷ GUS/columbia(AF)、p35S∷△C2-AhAREB1-GFP/pAhNCED1∷GUS/columbia(△C2)、p35S∷△C3-AhAREB1-GFP/pAhNCED1∷GUS/columbia(△C3)分别获得转基因株系5、6、6个,RT-PCR显示株系之间目的基因表达量有差异;  2、通过原生质体和转基因拟南芥根尖亚细胞定位观察,发现AhA.REB1保守结构域C1、C2、C3的缺失对转录因子进入细胞核无影响,AhAREB1、AhAREB1、△C2AhAREB1、△C3AhAREB1均能定位细胞核;  3、通过定性和定量分析各转基因拟南芥幼苗、成苗组织中GUS基因表达量发现,与拟南芥pAhNCED1∷GUS/columbia(CK)相比,AhAREB1、△C1AhAREB1显著性下调拟南芥AF、△C1中的pAhNCED1∷GUS表达,△C2-AhAREB1轻度抑制pAhNCED1∷GUS表达、△C3AhAREB1对pAhNCED1∷GUS表达无影响;  4、利用AhAREB1、△ C1AhAREB1、△ C2AhAREB1、△3AhAREB1分别与pAhNCED1∷Fluc瞬时转化拟南芥原生质体发现,AhAREB1能结合并显著性下调pAhNCED1∷ Fluc表达,△C1AhAREB1、△C2AhAREB1、△C3AhAREB1均轻度抑制pAhNCED1∷Fluc表达;  5、根据AhNCED1启动子上四个ABRE顺式元件存在的位置,将其划分为四个区域,通过免疫共沉淀(CHIP)证明,AhAREB1能结合第二、四个区域,与第一、三个区域无结合,推测AhAREB1能结合启动子上第二、四个ABRE元件,不结合第一、三个ABRE元件;在保守结构域的研究中,缺失保守结构域1、2不影响结合过程,但AhAREB1无转录活性,缺失保守结构域1、2、3时,AhAREB1不能有效结合AhNCED1启动子;  6、分析转基因拟南芥幼苗和成苗抗旱性、种子萌发时ABA敏感性显示,AF、△C1的幼苗和成苗干旱存活率分别为72%、74.67和66.67%、89.33%,显著性高于CK、△C2、△C3的幼苗存活率14.67%、16%、16%和成苗存活率6.67%、38.67%、4%,表明过表达AhREB1能显增强转植株抗旱性,且在该过程中保守结构域2是必需基序;对于种子萌发的ABA敏感性,转基因△C1AhAREB1、△C2AhAREB1、△C3AhAREB1的拟南芥敏感性显著性高于对照(CK)和AF;  综合以上结果可知,花生转录因子AhAREB1保守结构域1、2、3的缺失不影响AhAREB1进入细胞核,AhAREB1能通过结合基因AhNCED1启动子上的第二、四个ABRE顺式元件负调控基因表达,在该调控过程和提高植株抗旱性中,保守结构域1是非必需基序,保守结构域2是必需基序,该基序的缺失虽不影响AhAREB1与AhNCED1启动子的结合,但会使AhAREB1丧失转录活性;保守结构域C3的缺失则会使AhAREB1不能与AhNCED1启动子有效结合。
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