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稗草是稻田恶性杂草之一,严重影响水稻的产量,由此导致水稻栽培过程中除草剂大量使用,造成生态安全问题。针对伴生杂草,部分水稻品种具有向环境中分泌足够浓度的次生代谢物抑制其生长的特性,这种特性称为水稻化感作用。具有抑草作用的次生代谢物称为水稻化感物质。已报道的水稻化感物质包括酚酸类、萜类、黄酮类及其衍生物等。酚酸类化合物是一类重要的水稻化感物质,主要来源于苯丙烷代谢途径,苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL,EC 4.3.1.5)是该代谢途径的关键酶,其活性大小决定了酚酸类化合物含量的高低,化感水稻中的PAL活性及其基因表达水平高于非化感水稻,且逆境条件下化感水稻的PAL基因表达增强倍数明显高于非化感水稻。水稻中的PAL是基因家族,为揭示化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont的PAL家族基因表达差异的内在机制,本研究分别克隆PI312777和Lemont的PAL基因启动子,比较启动子的活性差异;对启动活性差异明显的启动子,比较其转录调控因子种类及表达差异,及启动子对应的PAL成员基因对水稻化感抑草能力的调控作用,研究PAL的蛋白作用网络,具体结果如下:1、分别克隆了化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont的PAL家族基因(Os02g0626100,Os PAL2;1;Os02g0626400,Os PAL2;2;Os02g0626600,Os PAL2;3;Os02g0627100,Os PAL2;4;Os04g0518100,Os PAL4;1;Os04g0518400,Os PAL4;2;Os11g0708900,Os PAL11)的启动子并进行测序,结果显示,PI312777和Lemont的相同PAL成员基因的启动子组成序列均存在差异,且以Os PAL2;3、Os PAL2;4基因启动子序列的差异最大;进一步采用烟草瞬时表达系统比较PI312777和Lemont的相同PAL成员基因的启动子活性差异,结果发现PI3127777的Os PAL2;3基因启动子的活性高于Lemont中该基因启动子的活性,两种水稻的Os PAL2;4基因启动子的活性则相反;将Os PAL2;3,Os PAL2;4基因的启动子融合绿色荧光蛋白基因(GFP)并转化水稻原生质体细胞,激光共聚焦显微观察结果也发现,PI3127777的Os PAL2;3基因启动子驱动下的GFP荧光强度大于Lemont的Os PAL2;3基因启动子驱动下的GFP荧光强度。进一步深入研究了Os PAL2;3基因的转录因子。2、分别对PI312777和Lemont的Os PAL2;3基因启动子进行生物素标记,利用启动子DNA pull-down技术获得启动子上的结合蛋白,结果发现,PI312777和Lemont的Os PAL2;3基因启动子上均结合着AT hook motif domain-containing protein,AT hook motif family protein,AT hook motif domain-containing protein,transcription regulator,histone H1,histone H4等DNA结合蛋白;除此之外,在Lemont的Os PAL2;3基因启动子的结合蛋白中还鉴定到Whirly transcription factor domain-containing protein(LOC＿Os02g06370,LOC＿Os06g05350)两个转录因子;进一步采用q PCR检测了Histone H4、Whirly transcription factor domain-containing protein(Os WHY,LOC＿Os02g06370,LOC＿Os06g05350)的编码基因在PI312777和Lemont中的表达水平,结果显示,稗草胁迫下,Lemont中的Histone H4,LOC＿Os02g06370,LOC＿Os06g05350基因表达较单独种植的Lemont对照组显著上调表达,而相同处理下的PI312777中的这三个基因的表达较对照组PI312777变化不明显,表明上述三个转录调控因子对Os PAL2;3基因转录水平具有负调控作用。3、克隆了PI312777的Os PAL2;3基因CDS并融合e YFP构建重组表达载体遗传转化PI312777、Lemont,比较转基因PI312777、Lemont较其各自野生型植株的抑草率变化,结果显示,过表达Os PAL2;3基因使得PI312777的抑草率提高11.11%,Lemont的抑草率提高5.56%。对转基因水稻和野生型植株中的酚酸类化合物的含量进行测定,结果显示过表达Os PAL2;3基因后,转基因水稻中的原儿茶酸和香草酸含量增加,总酚酸的含量也显著增加。利用q PCR检测苯丙氨酸代谢途径中相关基因的表达,结果显示转基因水稻中的Os PAL、Os C4H、Os CCA、Os COL、Os OMT基因表达增强。4、采用基于GFP-Trap的Co-IP在获得Os PAL2;3在水稻体内的互作蛋白,质谱鉴定结果显示,Os PAL2;3蛋白与转酮醇酶(transketolase)、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase)、果糖1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase)、ATP合酶α亚基(ATP synthase subunit alpha)、ATP合酶β亚基(ATP synthase subunit beta)等相互作用。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)结合激光共聚焦显微镜观察结果也显示,Os PAL2;3分别与上述蛋白存在互作。综上所述,化感水稻PI312777与非化感水稻Lemont的PAL基因表达灵敏度存在差异,其中Os PAL2;3在PI312777中的转录水平水稻高于Lemont,这与该基因的转录因子Os WHY的负调控作用有关;此外,过表达Os PAL2;3后,水稻的酚酸类化合物含量增加,化感抑草率提高,Os PAL2;3蛋白与转酮醇酶、碳酸酐酶、果糖1,6-二磷酸醛缩酶、ATP合酶α亚基、ATP合酶β亚基等多个蛋白相互作用,共同调控水稻的苯丙氨酸代谢途径。本研究结果表明,Os PAL2;3的转录水平高低是引起P1312777和Lemont化感抑草能力差异的原因之一,Os PAL2;3可作为利用分子遗传育种提高水稻化感抑草能力的候选基因。