棒曲霉Asp-195v蛋白酶的特性及其功能cDNA片段克隆的研究

• 作 者: 毕思远
• 出 处: 辽宁师范大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 棒曲霉 蛋白酶 纯化 酶学性质 基因克隆

蛋白水解酶催化蛋白质的肽链裂解,是一类在生理学和商业领域中具有广泛应用价值的酶。蛋白酶执行大量的不同的生理功能,几乎参与各种生物体的生理生化反应,包括正常和非正常状态的复杂的病理、生理功能。它们同样也存在于致病生物体的生活史中,所以它们也能够成为潜在的发展治疗因子的对象,来治疗一些可怕的疾病:如癌症和艾滋病等。蛋白酶在食品、皮革、医药、日化、清洁剂等工业中的应用也具有悠久的历史。微生物来源的蛋白酶,由于具有培养简便,产量丰富等优点,适于工业化生产而得以广泛应用。本论文前期对液体发酵的棒曲霉Asp-195v菌株所产蛋白酶的活力进行了条件优化,并通过硫酸铵盐析,Sephadex G-100凝胶层析和DEAE阴离子柱层析从Asp-195v培养的滤液中分离纯化获得了电泳纯的酶蛋白,并对该酶的特性开展了研究工作,结果表明:（1）当培养基成分中麸皮和豆粕的比例为7:3,含水量90mL,初始pH值7,培养时间72h,接种量1.5mL,培养温度24℃,摇床转数120r/min时为最佳培养条件。在最佳培养条件下测得的酶活力高达309.70U。（2）通过硫酸铵盐析,Sephadex G-100凝胶层析和DEAE阴离子柱层析,从Asp-195v培养的滤液中纯化出了一种胞外蛋白酶组分。其分子量为30.1kDa,所得样品被纯化了15.3倍,活力回收率为6.35。（3）该蛋白酶的最适反应温度为40℃,在30℃—50℃温度范围内相对活力可保持在70%以上;最适pH为7,pH稳定范围在4—8;Mn²⁺对该蛋白酶活力具有明显的激活作用,K⁺、Ag⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Al³⁺和Fe³⁺离子则有明显的抑制作用,尤其是Hg²⁺和Pb²⁺对酶活的抑制作用更加强烈;其他试剂如葡萄糖、EDTA对酶活的抑制作用不明显,而蔗糖、SDS、和Tween-20对酶活的抑制明显;以酪氨酸为底物采用双倒数作图法测得Vmax为30.40mmol/min,Km为97.53mmol/L。根据真菌蛋白酶的同源保守序列设计兼并引物,通过RT-PCR及快速扩增,克隆了该蛋白酶的编码功能基因cDNA为517bp,该基因已在GenBank中注册,DNA序列的登陆号为GU455424。研究结果为功能基因全长cDNA扩增和构建高效表达蛋白酶的基因工程菌株奠定了基础。