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研究背景与目的:脑卒中具有高致残率、高发病率、高死亡率的特点,在全球死因中位居其三。在中国,脑卒中拥有很高的发病率,且近年来出现逐渐增长的趋势。吞咽困难是脑卒中后最常见的后遗症,发病率高达51%～73%,吞咽困难会引起患者误吸、脱水及营养不良,吞咽困难不仅给患者带来了身体上的病痛,还会给患者带来心理上极大的危害,加大患者的经济负担和心理压力,使患者生活质量降低。现在对脑卒中后吞咽困难的西医治疗有多种手段,包括胃管置入法、球囊扩张术、药物治疗和康复训练、物理治疗等手段,可是无论什么治疗手段,都存在很多客观缺点,例如治疗成本高、对医护人员要求高、患者心理负担重不易坚持。目前吞咽困难的中医治疗包括中药内服和针灸治疗,结合康复训练,再辅以中药内服和针灸治疗,虽然具有良好的疗效,但是仍然面临很大局限与不足,例如中药内服容易引起误吸,针灸治疗某些穴位比如金精、玉液等,有一定危险性,且不易实施。口咽部给药作用面积大,且能深入咽部,故以利咽通窍法,制作中药喷雾剂,对改善吞咽困难更为有利,而且该法治疗吞咽困难更加简便、安全、有效。前期多项临床研究显示通咽喷雾剂对脑卒中后吞咽困难拥有良好的诊疗效果,而且尚未发现不良反应。研究结果表明,利咽通窍外治法是治疗脑卒中恢复期吞咽困难的有效方法,通咽喷雾剂是治疗该症的有效药物,临床应用前景广阔,但是其深层次作用机制有待进一步研究。通咽喷雾剂对脑卒中后吞咽困难的传出途径作用机制尚不明确,因此本课题建立舌下神经压榨损伤模型,从传出神经角度研究通咽喷雾剂对损伤后的舌下神经及其延髓吞咽中枢的作用,对探究通咽喷雾剂治疗脑卒中后吞咽困难的深层次作用机制有着重要意义,也能为临床推广提供重要依据。研究方法:(1)8周龄Wistar系雄性大鼠60只,随机分为假手术组、模型组、药物组,每组20只大鼠,从神经电生理角度切入,采用压榨法损伤舌下神经,建立模型,造模后舌咽部给予通咽喷雾剂后,分别在给药第7天、第14天两个时间点测定指标。检测舌下神经的神经电生理,每个时间点每组10只大鼠。(2)心脏灌注取材,并且制作冰冻切片。(3)尼氏染色法检测舌下神经核内神经元存活数目。冰冻切片复温,PBS洗涤,入甲苯胺蓝染液(37 ℃烤箱)40 min,水洗3次,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。(4)采用免疫组化染色检测给药后舌下神经核内神经递质降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptam,5-HT)、一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、乙酸胆碱(Acetylcholine,ACh)浓度的变化。(5)采用免疫组化染色,检测舌下神经核内p38的表达情况,研究通咽喷雾剂对舌下神经核内p38MAPK通路激活的影响。研究结果:(1)神经电生理检测结果①通咽喷雾剂对大鼠舌肌阈强度的影响:舌下神经压榨损伤后,与损伤侧假手术组相比,无论是7天还是14天,损伤侧模型组的阈强度明显升高(P<0.05);与模型组相比,损伤侧药物组的阈强度明显降低(P<0.05)。同时与第7天相比,第14天损伤侧药物组和模型组的阈强度均降低(P<0.05)。但无论7天还是14天时,非损伤侧模型组和药物组的阈强度与假手术组比较均无明显差异(P>0.05)。②舌下神经压榨损伤后,与假手术组相比,无论7天还是14天,损伤侧模型组的单收缩幅度和强直收缩幅度明显降低(P<0.01);与模型组相比,7天时,药物组单收缩和强直收缩幅度提高(P<0.05),14天时,药物组的单收缩幅度和强直收缩幅度明显提高(P<0.01)。与第7天相比,无论是药物组还是模型组,第14天时的单收缩幅度与强直收缩幅度均提高(P<0.05)。而无论7天还是14天,与非损伤侧假手术组相比,非损伤侧模型组和药物组的单收缩幅度和强直收缩幅度均无明显差异(P>0.05)。(2)甲苯胺蓝染色法检测舌下神经核内尼氏体数目,与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的尼氏体数目均减少(P<0.05);药物组与模型组相比舌下神经核内的尼氏体数目升高(P<0.05)。(3)免疫组化染色检测舌下神经核内神经递质①与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的CGRP含量增多(P<0.05);药物组与模型组相比,舌下神经核内的CGRP含量减少(P<0.05)。②与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的5-HT含量均减少(P<0.05);药物组与模型组相比舌下神经核内的5-HT含量明显升高(P<0.05)。③与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的神经元型一氧化氮合酶(Neuronal Nitric Oxide Synthase,nNOS)含量均升高(P<0.05);药物组与模型组相比,舌下神经核内的nNOS含量降低(P<0.05)。④与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的ACh含量均减少(P<0.05);药物组与模型组相比舌下神经核内的ACh含量明显升高(P<0.05)。(4)免疫组化染色法检测舌下神经核内p38的表达情况,与假手术组相比,舌下神经压榨损伤后,无论第7天还是第14天,模型组和药物组舌下神经核内的p38含量均升高(P<0.05);药物组与模型组相比,舌下神经核内的p38含量降低(P<0.05)。研究结论:(1)舌下神经的压榨损伤会导致舌肌收缩的阈强度升高,降低舌下神经-舌肌传导系统的灵敏性,造成吞咽功能障碍。通咽喷雾剂能够降低舌下神经损伤后的舌肌收缩阈强度,从而提高舌下神经-舌肌传导系统的兴奋性,提高舌肌的收缩能力,从而改善吞咽困难。(2)通咽喷雾剂可能一方面通过抑制p38MAPK通路的激活,减少舌下神经核内的nNOS表达,抑制NO的合成,从而抑制舌下神经核内神经元细胞的凋亡;另一方面可能通过抑制NO的合成,增加了舌下神经核内5-HT,ACh的释放,提高舌下神经兴奋性,最终改善吞咽困难。