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前言及目的：
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重威胁妇女的身心健康。宫颈癌主要以手术和放射治疗为主,但许多患者就诊时已经失去手术机会。随着肿瘤化学治疗的基础和临床研究的迅速进展,子宫颈癌新辅助化疗(neoadjuvantchemotherapy.NACT)逐渐受到学者们的重视。以铂类为基础的联合化疗提高了宫颈癌患者的生存期1,但因其对正常组织的细胞毒性及获得性耐药严重地制约了总体的化疗效果,因此,寻找一些对肿瘤细胞有相对选择性、毒性小、却有一定疗效并能够增加已有化疗药物的敏感性,是提高宫颈癌尤其是晚期患者生存率的关键。
有丝分裂错误是基因组不稳定的重要原因,与肿瘤生成密切相关。许多有丝分裂调节蛋白在肿瘤细胞中表达紊乱,这些蛋白因此可成为有用的治疗靶点。Aurora激酶家族是一组调节中心体、微管功能的丝氨酸和苏氨酸激酶。在细胞有丝分裂的正常进行中发挥重要的作用。哺乳动物细胞Aurora激酶家族成员的结构和功能在进化上保守,根据该家族各成员在细胞内的定位可分为3种:Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C2。Aurora-B是染色体的过客蛋白3-4,定位于有丝分裂早期的染色体的着丝粒区域,分裂后期则从着丝粒移至嵌入纺锤体赤道板的微管。随着纺锤体的延伸,细胞开始胞质分裂,Aurora-B集聚至纺锤体中央和细胞皮层的裂沟内移部位,最终在中间体聚集,Aurora-B与另3个染色体过客蛋白一内着丝粒蛋白(INCENP)、survivin和borealin结合,该复合体的主要功能是保证Aurora-B在有丝分裂前和有丝分裂期间正确定位并激活,对于染色体正确排列和分离有着非常重要的作用。Aurora-B是有丝分裂中组蛋白H3的10位丝氨酸磷酸化所必需的激酶,组蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,对于染色体浓缩非常重要5-6,当组蛋白H3磷酸化被抑制时,染色体浓缩被抑制,阻碍细胞进入有丝分裂,组蛋白H3磷酸化可作为Aurora-B的直接的下游靶分子来衡量Aurora-B激酶抑制剂对细胞是否起作用的一个标准。
研究发现Aurora-A、Aurora-B在肺癌、前列腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、食管癌等7-13许多恶性肿瘤中存在过表达,Aurora-A、Aurora-B的过表达可引起细胞基因组不稳定、有丝分裂错误、细胞恶性转变,抑制其表达可抑制细胞的增殖、促进细胞的凋亡。因此Aurora激酶家族已成为一个潜在的有价值的抗肿瘤治疗靶点。目前已有许多Aurora激酶抑制剂被报道14-17,ZM447439(C29H31N504x3H20)就是其中之一,属ATP竞争型抑制剂,它可阻止染色体排列、纺锤体检查点功能和胞质分裂。ZM447439处理的细胞不分裂即退出有丝分裂,细胞周期阻滞,多倍体增加,细胞体积变大,增殖能力下降,凋亡增加等18-19。Fiona Girdler20等通过RNA干扰和诱导突变等技术研究证实ZM447439引起肿瘤细胞的形态和生物学行为的改变是通过抑制Aurora-B激酶所致。
因Aurora-B激酶只在分裂增殖的细胞中表达,而人类正常细胞多处于稳定状态,肿瘤细胞分裂增殖活跃,故其抑制剂对肿瘤细胞有很强的选择性。本文首先检测了Aurora-B激酶在宫颈癌组织中高表达,然后应用ZM447439抑制Aurora-B并联合顺铂(cisplatin cDDP)作用于宫颈癌细胞,研究其对细胞生物学功能的影响及与cDDP是否有协同效应。以上问题的研究目前在国内外少见报道。通过本研究可为宫颈癌的靶向治疗和临床化疗提供新的思路。
实验材料及方法：
第一部分:应用免疫组织化学方法检测Aurora-B蛋白在不同富颈组织中的表达,然后分析Aurora-B蛋白与宫颈癌各临床病理参数的关系。
第二部分:采用MTT方法检测ZM447439对SiHa细胞增殖能力的影响;流式细胞技术分别检测ZM447439对SiHa细胞周期及细胞凋亡的影响;显微镜和电镜观察SiHa细胞形态学改变;蛋白印迹技术检测Aurora-B和磷酸化组蛋白H3(H3-P)的表达变化。
第三部分:采用MTT、流式细胞技术检测ZM447439联合顺铂对SiHa细胞增殖能力、细胞周期及细胞凋亡的影响;蛋白印迹技术检测HPV16E6、P53、BCL-2、VEGF蛋白表达的改变。
结果：
第一部分:Aurora-B蛋白在宫颈癌组织高表达,其次CIN,正常宫颈组织没有阳性表达。Aurora-B蛋白的表达与宫颈癌细胞的分化程度和病理类型有关(P＜0.05),与年龄,临床分期,淋巴转移情况无关(P＞0.05)。
第二部分:ZM447439以时间和剂量依赖的形式抑制SiHa细胞的增殖,引起细胞体积增大,数量减少,并出现凋亡改变。流式细胞技术显示ZM447439引起细胞G2/M期阻滞,及促进细胞早期凋亡。蛋白印迹技术显示ZM447439抑制了Aurora-B和H3-P蛋白的表达。
第三部分:MTT结果显示顺铂以时间和剂量依赖的形式抑制SiHa细胞的增殖,和ZM447439联用明显增强了顺铂的抑制增殖、促进凋亡的作用,引起S期明显抑制。抑制了HPV16E6、BCL-2、VEGF蛋白的表达,增强了P53蛋白的表达。
结论：
第一部分:Aurora-B可作为宫颈癌治疗的潜在靶点。Aurora-B在宫颈鳞癌和腺癌的发病机制中所起的作用可能存在差异。Aurora-B的表达与宫颈癌细胞的成熟程度有关。
第二部分:抑制Aurora-B的表达,进而抑制其重要的下游因子H3的磷酸化,可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖,促进细胞凋亡,引起细胞阻滞于有丝分裂期。
第三部分:抑制Aurora-B的表达能显著增强顺铂对宫颈癌SiHa细胞的化疗敏感性,显著诱导凋亡,两者具有协同作用。其机制可能与抑制HPV16E6、BCL-2的表达、促进P53蛋白功能恢复有关。