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目的： 睾丸间质干细胞（Stem Leydig cell，SLC）的发育受多种调节因子的影响，但目前其发育调节机制尚不清楚。大鼠 SLC 含高表达甲状腺旁腺激素受体 1 （PTH1R），一旦分化到间质细胞（Leydig cell，LC）系，该受体表达降到低水平，提示PTH1R可能调节SLC发育。本文探讨了PTH1R的配体甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）对 SLC 增生和分化的影响，并对其作用机制进行了深入的研究，旨在为SLC移植技术应用于治疗男性性功能低下症提供科学依据。 方法： 1.PTHrP体外实验：取成年（60日龄）雄性SD大鼠，经一次腹腔注射乙烷二甲烷磺酸（EDS，75 mg/kg）以彻底消除睾丸间质细胞（LC），注射后第4天处死大鼠，取睾丸，分离曲细精管，将曲细精管用SLC分化诱导剂（LDM培养基，含LH+Li）处理，并用0、10、100、1000pg/mL的PTHrP共处理3周，取培养基，采用化学发光法测睾酮；收集部分曲细精管提取RNA进行QPCR，测量LC的表达基因Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3和Hsd11b1的水平；收集部分曲细精管提取蛋白进行Western blot（WB），测量CYP11A1、CYP17A1、17β-HSD3、11β-HSD1 和 STAR 等 LC 蛋白水平。采用PKA拮抗剂（H-89）和PKC拮抗剂（U73122）与PTHrP共处理，探讨PTHrP作用机制。另外取曲细精管用0、10、100、1000pg/mL的PTHrP处理5天后，进行EdU掺入，测量SLC的增殖情况。 2.PTHrP体内实验：取18只成年（60日龄）雄性SD大鼠，腹腔注射EDS （75mg/kg）后，随机分为3组：0（生理盐水组）、10 ng/睾丸PTHrP组、100ng/睾丸PTHrP组，每组6只。从EDS第7天开始，每天睾丸内注射生理盐水或PTHrP （50?L），共21天。EDS后第28天处死大鼠，取血清，采用化学发光法测量血清睾酮，ELISA法测量血清LH水平。取睾丸称重，一只睾丸冰冻，一半组织提取RNA，QPCR法测量LC基因Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1、Hsd17b3、Srd5a1和Hsd11b1的表达；另一半组织提取蛋白，WB法测量LC蛋白LHCGR、CYP11A1、11β-HSD1、CYP17A1、SCARB1、STAR、CREB和p-CREB的表达水平；另一只睾丸用Bouin’s液固定，石蜡切片，免疫组织化学染色后期阶段LC生物标记11?-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）和所有LC生物标记胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1），测量 LC 的数量、大小、胞核大小、胞浆大小和它们的蛋白密度；部分切片进行免疫荧光共染色LC生物标记CYP11A1和增殖标记蛋白PCNA，测量LC细胞的增殖情况。 结果： 1.体外实验显示，LDM（含 LH+Li）培养 3周后，曲细精管表面出现大量CYP11A1阳性LC细胞，且培养基睾酮水平明显增加。不同浓度PTHrP与LDM共培养后，PTHrP 剂量依赖性地增高培养基睾酮水平，以 PTHrP（1000pg/mL）组睾酮水平最高，与对照组比较差异具有显著地统计学意义（P ＜0.01 ）。1000pg/mL的PTHrP与H-89或U73122共处理发现，H-89或U73122单独处理时，睾酮水平与对照组无统计学差异（P ＞0.05），但H-89或U73122与PTHrP共培养明显逆转PTHrP的作用（P＜0.01）。QPCR结果显示，100pg/mL的PTHrP明显上调 Star 的表达（P ＜0.05），1000pg/mL 的 PTHrP 明显上调 Cyp17a1 和Hsd17b3的表达（P＜0.01），但PTHrP不影响Lhcgr、Scarb1、Cyp11a1、Hsd3b1和Hsd11b1的表达。WB结果进一步验证，100pg/mL的PTHrP明显增加STAR蛋白水平（P＜0.01），1000pg/mL的PTHrP明显增加CYP17A1和17β-HSD3蛋白水平（P＜0.05）。PTHrP（1000pg/mL）处理5天后，未增加EdU掺入率，提示PTHrP不影响SLC增殖。 2.体内实验表明，PTHrP不影响大鼠体重及睾丸重量。与对照组比较，PTHrP （ 100ng/睾丸）明显增加血清睾酮水平（ P ＜0.05 ），但不影响血清 LH 水平（P＞0.05）。QPCR结果显示，PTHrP（100ng/睾丸）明显增加LC特异基因Lhcgr和Cyp11a1的表达。PTHrP剂量依赖性地增加CYP11A1标记的LC大小和胞质大小，以PTHrP（100ng/睾丸）组LC细胞体积和胞质体积最大（P ＜0.01）。半定量分析 CYP11A1 和 11β-HSD1 标记的 LC 细胞密度显示， CYP11A1 和11β-HSD1的密度呈PTHrP剂量依赖性增加，与对照组比较差异具有显著地统计学意义（P＜0.05），提示PTHrP诱导LC分化。体内WB数据显示，PTHrP（100ng/睾丸）明显增加LHCGR、CYP11A1、11?-HSD1、CYP17A1、SCARB1、CREB和p-CREB蛋白的表达量，且p-CREB/CREB水平也较对照组高，与对照组比较差异具有显著地统计学意义（P ＜0.05），提示PTHrP通过PKA-CREB信号通路增加p-CREB水平而调节SLC分化。PTHrP不影响CYP11A1和11?-HSD1阳性LC细胞数，PTHrP也不增加CYP11A1-PCNA率，提示PTHrP不影响LC增生。 结论： PTHrP刺激SLC的分化，但对SLC增殖无影响。PTHrP这一作用机制可能是通过介导PKA-CREB信号通路而实现的。