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第一部分Ghrelin通过PI3K/Akt通路抑制氧化应激诱导的成年大鼠心肌细胞凋亡目的观察ghrelin对高浓度葡萄糖和棕榈酸钠诱导的成年大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨ghrelin抗凋亡的细胞分子机制。方法分离培养原代成年大鼠心肌细胞,用高葡萄糖和游离脂肪酸诱导心肌细胞产生氧化应激。采用annexin-v-FITC/PI染色和caspase-3底物发光法检测心肌细胞凋亡,DCFH-DA荧光探针检测心肌细胞氧化应激,ELISA检测Akt和Erk磷酸化蛋白以及细胞核内NFκB含量,realtimePCR和westernblot检测抗凋亡基因的表达。结果①ghrelin能够抑制高糖和棕榈酸钠诱导的心肌细胞凋亡(P<0.05),但不能抑制氧化应激的产生。②ghrelin的抗凋亡作用能够被wortmannin阻断(P<0.05),但不能被PD98059阻断。③ghrelin能够刺激Akt和Erk1/2磷酸化,并且促使NFκB向细胞核移位。④wortmannin能够抑制NFκB向细胞核移位。⑤realtimePCR检测发现c-iap基因的表达在ghrelin刺激8h后达到高峰,是对照组的17.9倍。bcl-2、bcl-x1和c-fos基因表达20h后达到高峰,分别是对照组的12.2、4.4和4.3倍。⑥1μMghrelin刺激24h后,IAP-1和Bcl-2蛋白在心肌表达较对照组分别上升3.67倍和2.59倍。结论ghrelin有抑制氧化应激诱导的心肌细胞凋亡的作用,但ghrelin不具有抗氧化作用。ghrelin通过激活PI3K/Akt通路,导致BAD磷酸化,以及NFκB向细胞核转位增加抗凋亡基因表达实现抗凋亡作用。第二部分PI3K调节亚基P85α在自发性糖尿病大鼠心肌中表达下降目的研究糖尿病晚期病变心肌的胰岛素信号通路的改变。方法选用Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty(OLETF)和Long EvansTokushima Otsuka(LETO)分别作为实验组和对照组。采用基因芯片、相对定量Realtime PCR、Western blotting方法比较OLETF和LETO大鼠心肌p85α表达差异。结果与LETO组大鼠相比,OLETF大鼠血浆胰岛素水平下降(0.27±0.13 vs.2.39±0.34 ng/ml,p<0.000),甘油三脂和胆固醇增加(1.73±0.34 vs.0.48±0.08 mmol/L,p<0.000;4.41±0.21 vs.2.25±0.75 mmol/L,p<0.001),左心室内压舒张期下降速率(—dp/dt)降低30%(p<0.05)。基因芯片检测显示OLETF心肌组织中P85α基因表达量减少达8倍之多。Realtime-PCR和免疫印迹实验证实OLETF大鼠的P85α基因在转录和翻译水平较对照组大鼠分别下降了81.5%和43.2%(P<0.05、P<0.001)。结论类似人类2型糖尿病OLETF大鼠心肌组织胰岛素信号通路的关键分子P85α的mRNA和蛋白表达水平显著下降与心肌收缩舒张速率下降相关。