枣树Zj2-CP基因植物表达载体构建与功能验证

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枣树(Zizyphus jujuba)属鼠李科枣属植物,又称为华枣、红枣、普通枣。早在三千多年前枣树就是我国的主要经济树种,枣树的种质资源丰富,范围几乎分布全国的各个省份,主要分布于淮河及秦岭以北的丘陵、山区,它耐旱、抗盐碱、耐瘠薄。枣苗经过干旱和盐胁迫后对其生理特性测定发现,枣苗不同组织中几种抗氧化酶活性的表达量均比对照组高。进行实时荧光定量分析结果表明:随着胁迫时间的2-半胱氨酸氧化还原酶基因的相对表达量均高于对照组,说明2-半胱氨酸氧化还原酶基因有提高植株抗旱和耐盐的功能。对枣树2-半胱氨酸氧化还原酶基因进行序列分析表明:该序列cDNA全长为834bp,编码277个氨基酸,分子量为30.65KD,理论等电点为8.95,CG含量为45.68%,不稳定系数为41.56,脂溶指数为87.29,疏水性平均值为-0.12,此蛋白为膜外非分泌性蛋白。该基因编码的蛋白与已知物种2-半胱氨酸氧化还原酶基因编码蛋白的同源性为82%—99%,故将该基因命名为枣树2-半胱氨酸氧化还原酶(Zizyphus jujuba2-cys peroxiredoxin, Zj2-CP), DDBJ/EMBL/GenBank注册号为AB812086。将Zj2-CP连接到PEZR(K)-LNY,构建了植物表达载体PEZR(K)-LNY-Zj2-CP。通过冻融法将构建成功的植物表达载体转入农杆菌感受态细胞中,通过农杆菌介导法将阳性菌株转入拟南芥体内,经卡那霉素抗性筛选后共获得15个纯和的转基因拟南芥植株。通过激光共聚焦分析表明Zj2-CP在转基因拟南芥的不同组织部位,根、茎、叶中均有不同程度的表达。转Zj2-CP拟南芥和野生型拟南芥种子和植株胁迫处理发现,转基因拟南芥在50mmol.L-1—200mmol.L-1不同盐浓度的胁迫条件下其生长状况明显好于野生型拟南芥的生长状况,无处理转基因拟南芥和野生型拟南芥的生长状况基本相似,在300mmol.L-1、400mmol.L"1条件下转基因拟南芥和野生型拟南芥均不发芽,可见在一定的盐浓度条件下可以提高转基因拟南芥植株的抗盐性。实时荧光定量分析表明,野生型植株和转基因株系在经过干旱和盐胁迫后,其体内Zj2-CP基因的表达量均高于对照组的表达量,可见目的基因2-半胱氨酸氧化还原酶基因有提高植株抗旱性和耐盐性的功能。对转基因拟南芥植株和野生型植株进行干旱胁迫和盐胁迫后POD、CAT、APX、MDA酶活性测定表明,野生型拟南芥中相应的酶活性均高于转基因拟南芥中的酶活性,表明在干旱和盐胁迫下转基因株系主要启动Zj2-CP来抵抗外界环境,进一步验证了Zj2-CP基因能够提高植株的抗逆性。
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