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辣椒是一种重要的蔬菜作物和调味品。但由于各种病害的危害,辣椒的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性一直是十分重要的研究课题。通过常规育种手段从现有资源中选育出多抗、高抗、优质、高产品种难度大,耗时长。商陆属植物抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins,PAP)是从商陆属(Phytolacca)植物植株体内提取出来的一类碱性蛋白,对植物病毒、动物病毒、真菌、细菌有一定的抑制作用。在抗植物病毒方面,具有广谱性和高效性。利用其抗病毒活性主要有二种方法,一是对植物体直接喷洒商陆属植物抗病毒蛋白的汁液;另一种方法是把商陆属植物抗病毒蛋白的基因转入植物体,商陆属植物抗病毒蛋白基因在植物体中表达商陆属植物抗病毒蛋白致使植物体表现出抗性。
本研究旨在利用农杆菌介导方法把从商陆(Phytolacca acinosa)叶片中克隆得到的2个缺失无毒型PAP基因PacPAP1和PacPAP2(长为750bp,GenBank登陆号为AY603353和AY603354)导入到辣椒中,对转基因植株接种烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒,检测其对病毒的抗性。取得了以下结果:
1.辣椒遗传转化
用农杆菌介导法将商陆抗病毒蛋白基因PacPAP1和PacPAP2导入到了辣椒中:取真叶尚未长出时的无菌辣椒小苗制备Flamingo-bill外植体(将培养的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去,只留一侧子叶),在预培养基(MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2-0.5mg/L+AS(酰丁香酮)100mg/L+AgNO<,3>2.0mg/L(pH5.8)+3%蔗糖+7.0g/L琼脂粉)上暗培养2~3d;在OD<,600>值为0.4~0.8的菌液中浸染15min,黑暗中共培养基(同预培养基)2d;然后在抑菌培养基(预培养基+Cef(头孢霉素)200mg/L)上培养7d,再在筛选分化培养基(MS+ZT1.0mg/L+IAA 0.2mg/L+Cef 200mg/L+Km 50mg/L-AgNO<,3> 2.0mg/L+3%蔗糖+7.0g/L琼脂粉)上培养,每两周继代一次;获得抗性芽后转入选择伸长培养基(MS+ZT1.0mg/L+IAA0.2mg/L+Cef200mg/L+Km50mg/L+AgNO<,3> 2.0mg/L+GA<,3> 2.0mg/L+3%蔗糖+7.0g/L琼脂粉)上伸长,伸长的芽在生根培养基(MS+NAA 0.2mg/L+IAA0.1mg/L+3%蔗糖+7.0g/L卡拉胶)中诱导生根。A、B和C 3个材料都获得了一定数量的经卡那霉素筛选的抗性苗。
2.转化植株的分子生物学检测
对抗性苗进行PCR和PCR-Southern杂交表明部分植株外源基因已经整合到辣椒基因组DNA。共得到卡那霉素抗性植株43株,其中转PacPAP1基因有42株,A、B、C材料分别有33株、4株、5株;转PacPAP2基因C有1株。所做的28株检测植株中,PAP目的基因PCR检测阳性的有:转PacPAP1基因的共8株,B材料3株,C材料5株;转PacPAP2基因的C材料有1株;GUS基因PCR检测为阳性的有:转PacPAP1基因的A材料有2株,C材料有4株,转PacPAP2基因的C材料1株;NPTⅡ基因PCR检测阳性的有:转PacPAP1基因A材料5株、B材料3株、C材料4株。对GUS基因PCR阳性植株做PCR-southern杂交,检测为阳性的共有6株:转PacPAP1基因的A材料有1株,C材料有4株,转PacPAP2基因的只有C材料有1株。
3.转基因植株的抗病毒活性检测
接种TMV、CMV病毒30天后,非转基因植株都明显发病:其中接种TMV的植株表现严重花叶和黄叶;接种CMV的植株叶脉焦枯,顶芽黑色死掉,植株矮化。转PacPAP1基因植株(PCR-Southern杂交为阳性的植株)均未出现症状,对TMV、CMV表现抗性。