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目的：Ca2＋是人体内最普遍使用的信号转导因子，在细胞生命活动中起着重要的作用，所有类型细胞的各种功能均不同程度的被Ca2+调控。阳光中的紫外线辐射是一种非常显著的环境诱变因子，对角质形成细胞的损伤作用已经明确，而维生素C的抗氧化作用也有很多研究，其重要的抗氧化作用越来越受到重视。但目前在细胞水平上，关于维生素C对角质形成细胞光损伤的干预作用机制尚不完全清楚，是否与其钙调控有关尚未见报道。本实验首先用窄谱中波紫外线(NB-UVB)对角质形成细胞进行辐射，然后给予不同浓度的维生素C，着重通过观察细胞形态、细胞活性及细胞内Ca2+浓度变化来探讨维生素C的抗氧化作用与细胞内Ca2+浓度变化的相关性。
方法：角质形成细胞的分离与培养：收集该院泌尿外科青少年包皮环切术后的包皮组织，利用中性分离酶和胰蛋白酶联合消化法分离细胞，加入DMEM培养基制成细胞混悬液，转入25cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，隔天换液。原代角质形成细胞培养至15天左右细胞接近融合状态时胰蛋白酶消化，按1:3的比例传代，37℃、5％CO2培养箱中培养，次日更换培养基。以后视细胞生长情况隔天更换培养基。确定最佳辐射剂量：选择第四代对数生长期的细胞，消化后制成细胞混悬液，按1×105/ml接种于24孔培养板中，37℃、5％CO2孵箱中孵育24h，待细胞70％融合时辐射紫外线，分为8组：分别为空白对照组、30s组、1min组、3min组、4min组、5min组、6min组、8min组，每组设立三个复孔。照射后继续培养24h，倒置显微镜下观察细胞形态，并用台盼兰活细胞计数法检测细胞存活率，以细胞轻度受损，并在照射后可以很快恢复，细胞存活率在80％左右为最佳照射时间，以此确定最佳辐射剂量。分组处理：将对数生长期的细胞分别接种于6孔、24孔、96孔培养板中，待细胞接近融合时进行分组处理，实验分为以下6组：空白对照组、单纯NB-UVB损伤组、NB-UVB+0.10mmol/L维生素C组、NB-UVB+0.25mmol/L维生素C组、NB-UVB+0.50mmol/L维生素C组、NB-UVB+1.0mmol/L维生素C组，每组均设立3个复孔，各实验组均置于NB-UVB光源下辐射5min，然后给予不同浓度的维生素C，继续培养24h。倒置显微镜下观察细胞形态：将处理后的细胞置于倒置显微镜下观察空白对照组、单纯NB-UVB组及不同浓度维生素C组角质形成细胞的形态学变化。台盼兰染色检测细胞存活率：细胞按照上述处理方法处理，消化后制成细胞混悬液，用移液管将细胞悬液移入小试管中，加0.3％台盼兰染液浸染4min后，在倒置显微镜高倍镜下随机观察100个细胞，计数其中存活细胞数(蓝染的细胞为死亡细胞)，计算细胞存活率。MTT法检测细胞活性：孵育及照射方法同上，照射24h后各孔加入MTT，孵育4h后加入150μl DMSO，常温振荡，酶标仪492nm波长下测定各孔吸光光度值(OD值)。激光共聚焦扫描显微镜检测活细胞内游离Ca2+浓度：细胞按照上述方法处理后，加入浓度为5μmol/L的钙离子荧光探针rhod-2/AM，避光孵育30min，然后在激光共聚焦显微镜下扫描观察各组细胞的荧光强度。
结果：
(1)最佳辐射剂量：以10.2mW/cm2的NB-UVB强度照射各组角质形成细胞30s、1min、3min、4min、5min、6min、8min后观察细胞形态，5min组细胞受到中等程度的损伤，但损伤也逐渐恢复，细胞存活率轻度下降，各组差异有统计学意义。因此确定光照时间为5min，照射剂量为3060mJ/cm2。
(2)细胞形态学观察：空白对照组角质形成细胞呈扁平的三角形或多角形，细胞之间排列紧密，互相衔接成片，如铺路石样，各实验组细胞均有不同程度损伤，表现为细胞肿胀，严重者细胞碎片明显增多，部分漂浮于培养液中。
(3)角质形成细胞存活率：各实验组细胞存活率分别为74.6％、75.1％、81.4％、85.1％、65.6％，与空白对照组均存在显著差异，差异有统计学意义；表明3060mJ/cm2的NB-UVB照射可使角质形成细胞受损，生长受抑制，不同浓度的维生素C作用后虽可改变细胞的活性，但仍然低于对照组；0.25mmol/L维生素C组、0.50mmol/L维生素C组细胞存活率较单纯NB-UVB组均有升高，差异有统计学意义；而1.0mmol/L维生素C组的细胞存活率较单纯NB-UVB照射组显著降低，差异有统计学意义。
(4)OD值：各实验组OD值分别为0.81、0.75、0.76、0.98、0.40，与空白对照组(1.31)比较均降低，差异有统计学意义；0.50mmol/L维生素C组细胞OD值较单纯NB-UVB组有显著升高，差异有统计学意义；1.0mmol/L维生素C组的细胞OD值较单纯NB-UVB照射组明显降低，差异有统计学意义。
(5)各组细胞Ca2+荧光强度：各实验组荧光强度分别为54.5、55.1、54.6、40.0、7.6，与对照组(27.0)比较均有改变，差异有统计学意义；NB-UVB+0.1mmol/L，维生素C组、NB-UVB+0.25mmol/L维生素C组与单纯NB-UVB组比较差异无统计学意义；NB-UVB+0.50mmol/L维生素C组比单纯NB-UVB组荧光强度小，差别有统计学意义；NB-UVB+1.0mmol/L维生素C组的细胞荧光强度为7.6，远小于其他各组，差别均有统计学意义。
结论：
(1)窄谱中波紫外线对细胞的损伤作用较小，与普通中波紫外线相比，在相同累计剂量下副作用较小，但超大剂量的窄谱中波紫外线辐射也会对细胞造成不可逆转的损伤。
(2)维生素C对光损伤后的角质形成细胞具有保护作用，且这种保护作用在一定浓度下呈剂量相关性，超过一定浓度后反可加重细胞损伤。
(3)细胞内游离Ca2+浓度与细胞损伤程度呈正相关，结果提示维生素C对角质形成细胞光损伤的作用机制可能与细胞内的Ca2+调控有关