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支气管哮喘是发生于上呼吸道的一种常见的慢性炎症性疾病,在全球大约有3亿多哮喘患者,我国也有将近3千万的患者,而且发病人数在发展中国家呈持续上涨趋势。以呼吸急促甚至困难、咳嗽或伴有咳痰、胸闷和胸痛等主要临床表现。支气管哮喘以气道炎症、气道高反应性为主要病理变化,而长期的气道慢性炎症反应与机体的自我修复二者间反复的斗争与平衡,必然会导致气道壁增厚、气道组织结构改变而最终发生难逆性气道重塑。目前对于难逆性气道重塑尚无特效办法,仍以缓解患者呼吸困难、胸闷等临床症状为主。因此阐明气道重塑的分子机制,探究能够逆转气道重塑的新的分子靶点已成为支气管哮喘研究领域新的热点之一,对于重症支气管哮喘患者的治疗具有重要意义。细胞自噬是机体细胞通过分解代谢途径消化分解衰老死亡的胞质内容物、细胞器等的一种生理过程,在细胞的生长、分化中发挥重要作用。自噬发生时,一些相关蛋白表达异常。其中LC3、Beclinl和P62被认为是自噬发生的生物标志物。目前越来越多的研究证实细胞自噬与多种疾病例如肿瘤、代谢性疾病等的发生、发展密切相关。但其在哮喘气道重塑中的作用报道较少。同时STAT3-PKR是调节细胞生长、介导细胞存活和分化的重要信号通路之一,但关于STAT3-PKR信号通路在哮喘气道重塑中的研究尚未见到。因此深入探讨细胞自噬在支气管哮喘中扮演的角色和分子机制以及探讨是否可以通过STAT3-PKR信号通路中的重要靶蛋白减轻或逆转气道重塑具有重要理论意义。肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)是机体内重要的体液调节系统之一,是一个大家族,由血管紧张素原通过水解、酶解等作用生成多种血管紧张素家族成员。已证实在心血管、呼吸系统等存在着局部独立的RAS系统,调节局部的病理和生理学进程。血管紧张素(1-7)(Ang(1-7))是RAS大家族中的重要一员,已被证实在调节血管张力、心肌细胞增殖和体液调节等发面发挥重要作用。也有证据显示Ang(1-7)在脂多糖(LPS)和氧化应激诱导的肺损伤和肺纤维化可发挥保护效应。但尚未有研究报道揭示Ang(1-7)是否对卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)诱导的气道重塑具有逆转效应。基于此,我们认为探讨Ang(1-7)在气道重塑中的角色,可为发生了气道重塑的重症哮喘患者的治疗提供新的分子治疗靶点。同时JNK信号通路是MAPK信号通路的一个重要分支,在细胞增殖、凋亡和应激等多种生物学行为中均发挥重要调控作用。因此我们也探讨了 Ang(1-7)是否通过JNK信号通路发挥效应。因此在本研究中我们构建了经典的OVA-哮喘气道重塑模型,以细胞自噬和血管紧张素(1-7)作为切入点,分别研究了此二者在OVA诱导的气道重塑模型中,对气道炎症、纤维化与气道重塑的影响,在深入探讨了其发生机制,以期为普通哮喘患者的治疗和发生了气道重塑的重症哮喘患者的预防、治疗提供新的分子靶点、新的干预方向。第一部分 细胞自噬在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制目的建立经典的OVA诱导的哮喘气道重塑小鼠模型,并给与相应特异性抑制剂,研究细胞自噬与哮喘气道重塑间的关系,并深入探讨STAT3和PKR信号分子在其发生过程中的分子机制。方法在OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型中,检测了气道高反应性,通过组织染色,Western blot、IHC检测气道重塑的指标α-SMA和CollI的表达,确定发生了气道重塑。并利用WB、IHC和ELISA方法检测自噬相关标志物Beclinl、LC3和p62的表达,探讨在此模型小鼠中自噬的发生,进一步利用特异抑制剂WP1066(STAT3抑制剂)和PKRI(PKR抑制剂)干预后,深入探讨了 STAT3和PKR信号分子在OVA诱导的哮喘小鼠气道重塑中的作用。结果1.小鼠经OVA干预处理后,出现明显的气促、呼吸困难等症状,气道组织经HE、Masson和天狼星红染色后,发现模型组小鼠出现了明显的平滑肌层增厚、胶原纤维沉积、气道壁增厚和炎性反应等病理变化,同时经Western blot检测,α-SMA和CollI蛋白的表达量也明显增多,这些数据均说明支气管哮喘气道重塑小鼠模型成功制备;2.经说estern blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclin 1,LC3和P62的表达,结果显示模型组中Beclinl和LC3的表达量明显降低,而P62的表达量明显升高,说明在发生了气道重塑的支气管哮喘小鼠气道组织中细胞自噬现象被抑制;3.经WP1066抑制剂干预后,Western blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclinl,LC3和P62的表达,结果显示模型组中Beclinl和LC3的表达量明显升高,而P62的表达量明显降低;同时,HE、Masson和天狼星红染色后,也发现WP1066干预后,小鼠气道组织的气道重塑现象明显减轻,说明WP1066可通过抑制STAT3信号分子,激活细胞自噬,从而减轻或逆转OVA诱导的气道重塑效应;4.经PKRI干预后,Western blot、IHC和ELISA检测自噬标志物Beclinl,LC3和P62的表达,结果显示其表达水平与模型组相似;同时,HE、Masson和天狼星红染色后,也发现PKRI干预后,小鼠气道组织的气道重塑现象与模型组相似,说明PKRI可通过抑制细胞自噬激动剂PKR的表达,抑制细胞自噬,诱导气道重塑的发生;5.Western blot检测p-STAT3和p-PKR的活性水平,结果显示模型组中p-STAT3和p-PKR的活性水平升高,而WP1066抑制剂干预后,p-STAT3的活性明显降低,同时p-PKR的活性增强;PKRI干预后,p-PKR的活性明显降低,而p-STAT3的活性无明显变化,说明细胞自噬通过影响p-STAT3和p-PKR的活性水平,介导细胞自噬效应,在气道重塑中发挥重要作用。结论OVA诱导小鼠气道发生了明显的气道重塑病理变化,同时细胞自噬被抑制,而且此抑制效应与STAT3-PKR信号通路有关。第二部分 血管紧张素(1-7)在OVA诱导的哮喘气道重塑中的作用及机制目的研究Ang(1-7)在经典OVA哮喘气道重塑模型小鼠对气道炎性反应和气道重塑中的作用并揭示发挥效应的信号通路。方法建立OVA哮喘气道重塑小鼠模型,并给与Ang(1-7)和特异性抑制剂A779后,收集肺泡灌洗液、血清,气道组织,分离嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞,采用ELISA、组织HE、Masson和Giemsa染色以及Western blot等研究方法确定了 Ang(1-7)干预后对哮喘小鼠气道炎性和气道重塑的影响,并检测了炎性细胞数量和相关促炎因子的表达,并深入探讨了 JNK信号通路在其中的作用。结果1.50只不同处理因素干预的BALB/c小鼠,经Giemsa染色后,发现在模型组小鼠肺泡灌洗液中,嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数目明显增多,Ang(1-7)干预后炎性细胞数目明显减少,而A779抑制剂可逆转Ang(1-7)的保护效应;ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的炎性因子水平,也呈现出同样的变化,同时气道反应性检测结果显示,模型组小鼠气道反应性提高,Ang(1-7)干预后气道反应性明显降低,均说明Ang(1-7)可减轻OVA诱导的小鼠气道炎性反应;2.不同处理因素干预的BALB/c小鼠,气道组织染色结果显示,模型组小鼠发生了明显的平滑肌层增厚,气道重塑病理变化,而Ang(1-7)干预后,可明显减轻此病理变化,A779抑制剂可逆转Ang(l-7)的这一效应;平滑肌增殖的生物标志物α-SMA和CollI的表达量,经Western blot检测后,也呈现出与染色结果一致的变化。说明Ang(1-7)可减轻OVA-诱导的小鼠气道重塑病理变化;3.Western blot检测结果显示,模型组中OVA通过提高p-JNK活性水平增强α-SMA和CollI的表达水平,而Ang(l-7)可降低p-JNK活性水平,下调α-SMA和CollI的表达量,而A779抑制剂可抑制Ang(1-7)的这一效应。说明Ang(1-7)通过提高p-JNK活性,影响OVA-介导的哮喘小鼠气道重塑效应;4.JNK抑制剂SP600125干预后,Western blot检测了上皮细胞中α-SMA和CollI的表达水平,ELISA检测了促炎因子IL-4、IL-5和IL-13的含量。结果显示SP600125干预后,p-JNK活性被抑制,α-SMA和CollI表达量下调,IL-4、IL-5和IL-13的含量也下调。说明Ang(1-7)通过影响JNK信号通路发挥减轻或逆转OVA诱导的哮喘小鼠炎性反应和气道重塑效应。结论OVA诱导小鼠气道发生明显的炎症反应和气道重塑,Ang(1-7)可通过提高p-JNK蛋白活性,降低促炎因子IL-4、IL-5和IL-13的含量,下调α-SMA和CollI蛋白的表达量,减轻或逆转OVA诱导的炎症反应和气道重塑效应。