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顺铂(Cisplatin,CDDP)主要用于晚期或应用手术治疗后复发的喉癌患者,然而,仅有部分患者对以顺铂为基础的的化疗方案显示有效,耐药是限制喉癌患者疗效的因素之一。上皮间质转化在肿瘤中是指上皮源性肿瘤细胞转变为间质特性细胞的过程,Snail、Slug是参与上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中锌指转录因子家族中的成员,可通过抑制上皮标记物E-cadherin表达而启动细胞EMT过程。实验表明,EMT、肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)及侵袭转移特性在肿瘤耐药中发挥重要的作用。然而,由EMT参与的喉癌顺铂耐药形成及其恶性生物学行为的作用机制仍不十分明确。目的1.构建喉癌顺铂耐药细胞株,分析其恶性生物学特性;2.研究上皮间质转化在喉癌顺铂耐药细胞中的作用,以及干扰Snail对顺铂耐药产生的影响。方法第一部分构建喉癌顺铂耐药细胞株,分析其恶性生物学特性采用药物浓度递增法诱导喉癌Hep-2细胞建立顺铂耐药细胞株Hep-2/CDDP;CCK-8法检测细胞活力并计算IC50(Half maximal inhibitory concentration)、耐药指数(Resistant index,RI);无血清细胞球体培养观察成球能力;实时定量RT-q PCR和Western blot分别检测MDRl/P-gp、ABCG2、CD44、CD133的m RNA、蛋白的表达;Transwell、划痕实验检测细胞的侵袭迁移能力。第二部分研究上皮间质转化在喉癌顺铂耐药细胞中的作用,以及干扰Snail对顺铂耐药产生的影响利用Hep-2细胞和顺铂耐药的Hep-2/CDDP细胞,分别提取两种细胞m RNA、总蛋白,应用RT-q PCR、Western blot检测上皮表型E-cadherin、Zo-1,上皮间质转化转录因子Snail、Slug、Twist1,间质表型分子Vimentin m RNA及蛋白的表达;采用小干扰RNA(si-RNA)技术靶向沉默Hep-2/CDDP细胞中Snail的表达,RT-q PCR检测其干扰效率;免疫荧光法检测干扰组(si-Hep-2/CDDP)与对照组中Snail蛋白表达情况;CCK-8检测干扰组和对照组对0、1、2、4、8、16ug/ml不同浓度的顺铂抑制率;蛋白印迹Western blot法检测干扰组和对照组处理前后Snail、E-cadherin、P-gp蛋白的表达。结果第一部分顺铂体外缓慢诱导历时12个月建立了Hep-2/CDDP耐药细胞,与亲本细胞相比,细胞体积增大,长梭形状细胞增多,耐药性能稳定耐药指数为5.43;无血清球体培养实验示细胞成球率升高;RT-q PCR和Western blot结果表明耐药相关基因MDRl/P-gp、ABCG2表达上调;干性相关标记基因CD44、CD133表达上调;Transwell结果显示穿过基质胶的数量高于亲本细胞;划痕实验示Hep-2/CDDP细胞划痕愈合面积百分比高于Hep-2细胞。第二部分Hep-2/CDDP细胞上皮表型E-cad、Zo-1 m RNA及蛋白表达水平较Hep-2细胞降低;EMT相关核转录因子Snail、Slug表达水平较Hep-2细胞升高,Twist1蛋白水平表达无明显变化;间质表型Vimentin m RNA及蛋白表达水平较hep-2细胞升高;RT-q PCR结果显示靶向沉默Snail后干扰组细胞Snail表达较对照组下降(67.85±9.5)%;免疫荧光实验示干扰组细胞核及细胞质中Snail荧光强度均下降;CCK-8实验示:不同浓度顺铂作用后,与耐药细胞Hep-2/CDDP相比,干扰组抑制率较对照组升高;Western blot示Snail干扰组蛋白水平较耐药细胞组表达下调,同时上皮表型标记E-cadherin表达上调,多药耐药蛋白MDR1表达下调。结论第一部分人喉癌顺铂耐药细胞中耐药蛋白P-gp高表达,耐药细胞具有比亲本细胞增强的干细胞特性、侵袭迁移能力。第二部分人喉癌顺铂耐药细胞发生了上皮间质转化,且Snail表达上调;干扰Snail可增强喉癌对顺铂的敏感性,上调E-cadherin表达、使P-gp表达下降;