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随着转基因植物的商品化种植，抗性标记基因潜在的生态和食用安全性一直是一个颇有争议问题，已成为转基因植物产业化应用的主要障碍。培育无抗性标记或具有安全选择标记的转基因植物目前已成为植物基因工程研究的热点。甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)作为安全标记基因前人已有文献报道，来源于高等植物藜科的BADH基因在植物体内催化有毒的甜菜碱醛(BA)转变成无毒的甜菜碱，只要在转基因植株的筛选培养时添加适量BA施加选择压即可。由于起源于植物且催化产物甜菜碱是植物的渗透调节物质，BADH基因不仅安全而且可以提高作物的抗逆境胁迫能力。但在实际的应用中发现，筛选剂BA由于价格昂贵，限制了该基因作为安全标记的应用。因此，本研究利用BADH基因遗传转化后能提高作物耐盐耐旱能力的特性，在筛选转基因植株时添加氯化钠(NaCl)施加选择压，探索NaCl作为筛选剂在甘蓝遗传转化应用中的可行性，以期建立一种新型的转基因安全筛选体系。
研究构建了仅含BADH基因、不含抗生素标记基因的植物表达载体，与含新霉素磷酸转移酶基因(nptII)抗性标记基因的植物表达载体共同对甘蓝进行遗传转化，首次获得NaCl抗性植株。同时，转基因甘蓝的耐盐和抗旱能力也有所提高。主要研究工作及其结果如下：
1.以BADH基因为筛选标记的植物表达载体构建
根据BADH基因序列，从植物表达载体pBIBB(含nptII和BADH基因，BADH基因作为目的基因)中PCR扩增出BADH基因片段，亚克隆入pMD-18T载体，序列测定验证基因正确性，用XhoI酶切后，连入经相同经XhoI酶切的pCAMBIA3301表达载体，构建成含BADH基因的无抗生素筛选表达载体pCABMG，并将其转化到根癌农杆菌LBA4404中。
2.甘蓝高频再生体系的建立
采用不同NAA和BA配比，建立了甘蓝下胚轴不定芽分化高频再生体系。甘蓝下胚轴不定芽分化和增殖最佳培养基为：MS+NAA0.02mg/L+BA1mg/L；最佳生根培养基为：1/2MS+0.02mg/LNAA。
3.卡那霉素(Kan)和氯化钠(NaCl)临界致死浓度试验
采用不同浓度Kan和NaCl进行临界致死浓度梯度试验，确定了卡那霉素适宜筛选浓度为50mg/L。NaCl适宜筛选浓度为200mmol/L。
4.甘蓝高效转化体系的建立
采用L9(34)正交设计，以pBIBB作为转化载体，Kan为筛选剂，研究了不同类型侵染液、不同乙酰丁香酮浓度、不同侵染时间和不同共培养时间对甘蓝转化效率的影响，建立了甘蓝高效遗传转化体系。试验结果表明，9号组合为最佳处理组合，即以侵染液为AAM液体培养基、乙酰丁香酮浓度为200μmol/L、侵染时间20min、共培养天数2d为最佳转化参数，转化率最高可达54.2％。
5.甘蓝NaCl抗性植株的获得
利用优化的转化参数，采用pBIBB和pCABMG两个表达载体，以NaCl作为筛选剂，对甘蓝进行遗传转化并获得了抗性植株，载体pBIBB共进行了12个重复671个外植体的遗传转化，最后获得了40个仍保持绿色的抗性芽，平均转化率为3.49％。载体pCABMG共进行了8个重复440个外植体的遗传转化，最后获得15个抗性芽，平均转化率为3.11％。
6.转基因植株的分子检测
用BADH基因两端引物对200株pBIBB载体转化的抗性植株(Kan初筛植株160株，NaCl初筛植株40株)进行了PCR检测，共有60株扩增出1.5kb的特异条带，其中卡那抗性植株有50株，NaCl植株为10株。对15株pCABMG载体转化的NaCl抗性植株进行PCR检测，结果8株有1.5kb的特异扩增带。选取扩增结果较好的片段进行PCR-Southern杂交，以未转化的甘蓝植株为阴性对照，质粒pBIBB中BADH基因PCR扩增产物为阳性对照，质粒扩增的片段和部分转化植株的片段能够与由BADH制备的探针杂交，而阴性对照则无杂交信号。从PCR-Southern阳性植株中随机选取6株进行Southern杂交作进一步鉴定，结果4株出现了杂交带，表明这些植株确属转基因植株，BADH基因已成功整合到甘蓝基因组中。
7.转基因植株的BADH酶活性分析
对转基因植株分别采用NaCl和PEG胁迫处理，经过BADH酶活性测定，结果表明，转基因植株中的BADH酶的比活力范围在2.1-3.8U/mg之间，株系之间差异较大，转基因植株中的BADH酶的比活力比未转基因植株的高出1-3倍，SSR检验表明：转基因植株转基因和非转基因植株的BADH酶活性差异显著。对转基因甘蓝植株的BADH酶活性进行SSR检验表明：浇NaCl和浇PEG处理的植株BADH酶活性均较未胁迫处理高，达到了显著水平，这说明BADH基因在受到逆境胁迫时，能促进BADH基因的表达，产生更多的甜菜碱，从而提高植株的抗盐和耐旱能力。
8.转基因植株相对电导率测定分析
相对电导率测定结果表明，转基因植株相对电导率明显低于未转基因植株。对转基因和非转基因甘蓝相对电导率进行SSR检验表明：未转基因植株与转基因植株间的相对电导率达到了极显著水平(P<0.01)；对转基因甘蓝相对电导率进行SSR检验表明：在转基因植株中，未胁迫处理与浇PEG处理差异达到了显著水平(P<0.01)；未胁迫处理与浇NaCl处理差异达到了极显著水平(P<0.01)。表明转BADH基因植株在干旱和盐碱胁迫条件下细胞膜受损伤的程度有所减轻，转基因株系对逆境的耐性有了一定程度的提高。
9.转基因甘蓝植株的形态学观察
对转基因甘蓝植株的形态学观察表明，转基因植株的形态正常，未发生畸形突变。转基因甘蓝的抗旱耐盐能力均显著提高，在干旱和盐碱胁迫下，转基因植株能正常生长，其生长势优于未转基因的对照。
在此研究中，我们利用BADH基因作为筛选标记基因，以NaCl为筛选剂，进行甘蓝的遗传转化，并最终获得了具有食用安全性的NaCl抗性植株。甘蓝等作为人们日常食用的重要蔬菜作物，常作为转基因研究的对象来改良其抗虫、抗病和抗逆等品质，甚至于进行口服疫苗的表达来达到预防和治疗人类疾病的目的。此研究所取得的成果，创制了BADH/NaCl新型安全筛选体系，为蔬菜等可食用作物的转基因开辟了一种新的可能途径，并且为利用耐胁迫基因建立新型的转基因筛选体系提供了新的思路。