【摘 要】
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植物冷胁迫相关蛋白是指从耐寒物种中分离得到的参与调节植物抗寒生理生化活动的特殊蛋白质，其中一类能抑制冰晶形成的蛋白质被称为植物抗冻蛋白。植物抗冻蛋白能结合于冰晶表
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植物冷胁迫相关蛋白是指从耐寒物种中分离得到的参与调节植物抗寒生理生化活动的特殊蛋白质，其中一类能抑制冰晶形成的蛋白质被称为植物抗冻蛋白。植物抗冻蛋白能结合于冰晶表面，阻止冰晶生长，非依数性地降低溶液冰点而不降低熔点，导致熔点与冰点之间出现差值，即表现为热滞(Thermal hysteresis, TH)活性，还可抑制冰晶之间发生重结晶，即重结晶抑制(Recrystallization inhibition, RI)活性。与昆虫和鱼类抗冻蛋白相比较，植物抗冻蛋白的热滞活性极低，却具有极高的重结晶抑制活性，因此，植物抗冻蛋白亦被称为重结晶抑制蛋白(IceRecrystallization inhibition Protein, IRIP)。不同物种来源的植物重结晶抑制蛋白差异较大，基因序列之间的相似性很低，其作用机理至今未完全解析清楚。多年生黑麦草是耐寒性极强的常绿植物，内含活性较高的IRIP，应用前景较大。为探索黑麦草IRIP的遗传特性，对IRI3基因进行了克隆与功能分析研究。将多年生黑麦草设置温度梯度进行冷胁迫处理，运用实时定量PCR技术分析黑麦草在不同温度冷胁迫下LpIRI3的表达特性，发现该基因在黑麦草生长的各个时期均有表达，但是表达量有显著变化，在黑麦草在受冷胁迫约-10℃的表达量到达峰值。根据GenBank公布的黑麦草重结晶抑制蛋白的序列，将冷诱导黑麦草叶片总RNA逆转录成cDNA第一链，以此为模板，设计一对特异引物扩增黑麦草IRI3的cDNA序列。将获得LpIRI3基因与克隆载体pAD-MUT双酶切后连接，构成克隆载体pAD-LpIRI3，并测序检验。将LpIRI3基因与表达载体pGEX-4T1双酶切后连接，构建成表达载体pGEX-4T1-GST-IRI3，酶切鉴定后转化表达菌株BL21，使用终浓度1mM的IPTG进行诱导表达，通过SDS-PAGE检测、GST琼脂糖树脂纯化和Western Bolt检测，证明通过该方法表达的蛋白就是所需要的目的蛋白，LpIRI3蛋白分子量约为26kDa。
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