论文部分内容阅读
乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的乙型肝炎严重影响着我国人口健康。由于该病毒为“非溶细胞”性病毒,且病毒感染后不能诱导干扰素的产生,故HBV感染后常易造成对宿主细胞的免疫逃逸而建立起病毒的慢性感染。慢性乙肝病毒感染者发展为肝硬化和肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的几率较高。细胞自噬(Autophagy)是真核细胞用于清除胞内聚集物、损伤细胞器而维持其稳态平衡的一种溶酶体降解途径。近年来研究发现,细胞自噬不仅在细胞生长发育、成熟分化等过程中起着重要的作用,且与多种疾病发生、病毒感染与免疫等密切相关。为研究乙肝病毒诱发肝癌以及免疫逃逸的机理,本论文首先研究了乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响,利用HBV表达质粒瞬时或者稳定转染不同的肝癌细胞,通过计数GFP-LC3聚集数目检测自噬小体形成,westernblot检测LC3的脂酰化和p62的降解,结果表明HBV感染能够增强细胞基本水平的自噬。进一步研究发现,HBx表达质粒同样能增强细胞基本水平的自噬,而且C型HBx比B型对细胞基本水平自噬的增强程度更加显著,这说明HBV是通过HBx增强细胞基本水平的自噬的,同时为阐明不同基因型HBV感染造成的病情轻重以及临床表现的差异提供了思路。
乙肝病毒是有包膜的部分双链DNA病毒,属嗜肝DNA病毒科。在乙肝病毒出芽时要经过内质网-高尔基体中间体,然后成熟的病毒粒子再通过双层膜结构的包裹到达细胞表面,释放到胞外,但是对于双层膜结构的来源和运输的机制有待进一步阐明。乙肝病毒感染能显著地增强细胞基本水平的自噬,同时细胞自噬能产生大量的双层膜结构,HBV可能利用细胞自噬的双层膜结构完成其非裂解性地释放过程,而使被感染细胞保持完好,造成了免疫逃逸。为了研究细胞自噬对HBV出芽释放的影响,我们利用免疫荧光的方法证实HBV包膜蛋白HBs与细胞自噬标志蛋白LC3在细胞中存在共定位现象,之后分别用药物和siRNA的方法对细胞自噬进行抑制,结果发现,胞外病毒包膜蛋白HBs和HBV DNA减少,胞内病毒包膜蛋白HBs和HBs mRNA增加或保持不变。这一结果表明,细胞自噬有利于HBV出芽释放,这为进一步阐明HBV的出芽机理,以及对HBV的预防和治疗提供了新的思路。