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背景及目的 大脑的血管新生（angiogenesis）是指新生的毛细血管从已存在的血管侧枝的出芽与重塑。局灶脑缺血后;新生的侧枝血管可以有效改善缺血周围组织的血流灌注和促进神经功能恢复。以血管内皮细胞（endothelial cells; ECs）为切入点;刺激脑内毛细血管生成;恢复有效脑血流的干预措施可能成为新的卒中临床治疗手段。 生长分化因子11（growth differentiation factor 11;GDF11）可以逆转与年龄相关的大脑的功能衰退;部分地复制异时性联体共生（heterochronic parabiosis）模型（一种通过特殊的外科技术将两个不同年龄动物的血液循环相互联结的技术）的“再年轻”效应（rejuvenating effects）。在无病的年老小鼠中;GDF11 可以刺激脑初级毛细血管 ECs增生;参与血管重构;增加血管体积;改善嗅觉分辨力;促进血管和神经的“再年轻”。而且在体外实验中;GDF11 可以促进内皮祖细胞（endothelial progenitor cells; EPCs）迁移和出芽。 以上发现促使我们进一步研究;在脑缺血 /再灌注（ischemia/reperfusion;I/R）大鼠模型中;GDF11 是否具有血管生成因子的作用;促进血管新生;改善有效血流灌注;并促进神经功能恢复。 基于上述理由;本研究采用大鼠局灶性右侧大脑动脉缺血/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion;MCAO/R）模型;以脑缺血区周围皮质的血管新生为切入点;以 GDF11 为研究中心;采用免疫组化、免疫荧光双标、western-blot、qPCR、ELISA等研究方法;观察 GDF11 对神经行为学和血管新生的影响和下游作用机制以及脑缺血后 GDF11 表达的时空规律;探索脑缺血后 GDF11 和血管新生之间的关系;研究 GDF11 参与局灶脑 I/R 大鼠血管新生的分子机制。 方法 第一部分：制作大鼠局灶性右侧 MCAO/R 模型;以外源性尾静脉注射重组生长分化因子11（recombinant growth differentiation factor 11;rGDF11）为干预措施;使用、筛选不同的 rGDF11 注射剂量（0.01 mg/kg/d、 0.03 mg/kg/d、0.1 mg/kg/d和0.2 mg/kg/d）;选择大脑缺血区周围皮质为观察部位;以缺血后7d为观察时间点;初步研究不同剂量rGDF11 对脑 I/R 大鼠神经行为学评分（mNSS 和粘帖移除实验）和缺血区周围皮质 CD34 表达的影响;并进一步筛选出最佳 rGDF11 剂量用于下一步实验。 然后以尾静脉注射最佳剂量 rGDF11 和腹腔注射 ALK 抑制剂SB431542 4.2 mg/kg/d为干预措施。观察更长的时间（7 d或14 d）。大鼠造模前和再灌注后7 d 和14 d进行神经行为学评分。Western-blot 检测磷酸化Smad2/3（pSmad2/3）蛋白质表达;免疫荧光双标检测CD31+ Ki67和CD31 + ALK5表达。 FITC-dextran 静脉灌注的方法标记功能性血管;分析计算血管表面积和血管分支数目。 第二部分：制作大鼠局灶性 MCAO/R 模型;以经皮耳迷走神经电刺激（transcutaneous auricular vagus nerve stimulation;ta-VNS）为干预措施;选择血液、脾脏和大脑缺血区周围皮质为观察部位;以24 h、3 d、7 d为观察时间点。予直流电刺激（0.5 mA 方形波;波宽 0.5 ms;频率 20 HZ;连续刺激 30 s;每 5 min 刺激1次;总共持续 1 h）。每天刺激2次。大鼠造模前和再灌注后24h、3 d 和7 d进行神经行为学评分（mNSS 和粘帖移除实验）。TTC 染色测量脑梗死体积。ELISA 法检测血液中 GDF11 表达;免疫组化法和 Western-blot 检测缺血区周围皮质 GDF11 蛋白质表达;qPCR 检测检测缺血区周围皮质 GDF11 mRNA 表达;免疫组化法检测脾脏 GDF11 蛋白质表达;免疫荧光双标检测缺血区周围皮质CD31+ALK5和CD31+Ki67表达。 结果 第一部分：大鼠静脉注射 rGDF11 7 d后;随着静脉注射剂量增加; mNSS 和粘帖移除实验评分逐渐降低。与 I/R 组比较;0.1 mg/kg/d和0.2 mg/kg/d剂量组降低有统计学差异（p < 0.05）;但两组组间比较无差异 (p>0.05)。大鼠静脉注射0.1 mg/kg/d rGDF11 7 d后;脑缺血坏死区周围皮质中 CD34 表达较单纯脑I/R明显增加（p<0.01）。 脑 I/R大鼠静脉注射0.1 mg/kg/d rGDF11 7 d后;可激活缺血区周围皮质中下游信号通路 ALK5 在 ECs 上的表达和 pSmad2/3 蛋白质表达。而同时腹腔注射SB431542 可抑制 pSmad2/3 蛋白质表达（p<0.05）。 脑 I/R 大鼠静脉注射 0.1 mg/kg/d rGDF11 7 d 后;与单纯 I/R 相比;脑缺血坏死区周围皮质的 CD31++Ki67+ 细胞明显增加（p<0.01）;静脉注射 rGDF11 14 d 后;与单纯 I/R 相比;脑缺血坏死区周围皮质的总血管表面积（p<0.01）和血管分支计数（p<0.01）明显增加;有效血流灌注改善。同时腹腔注射 SB431542 抑制 GDF11 的促进血管新生（p<0.01）和改善有效血流灌注（p<0.01）作用;且这种抑制作用可能是通过抑制 pSmad2/3 蛋白质表达来实现的。 第二部分：大鼠脑 I/R后;血液、脑缺血区周围皮质 GDF11 表达增加 (p<0.05) ;表达高峰大约是再灌注后3 d;脾脏 GDF11 表达减少 (p < 0.05) 。提示了循环性因子 GDF11 从脾脏动员;进入血液循环;并再分布到脑缺血区周围皮质可能机制。ta-VNS 对脑 I/R 大鼠改善神经行为学评分 (p < 0.05) ;减少梗死体积 (p < 0.05) ;上调GDF11 在血液、脑缺血区周围皮质表达 (p<0.05) ;下调 GDF11 在脾脏表达 (p<0.05) ;促进 GDF11 的动员和再分布;诱导 GDF11 的受体 ALK5 在 ECs 上的表达 (p < 0.05) ;刺激血管 ECs 增生 (p <0.05)。 结论 （1）静脉注射 rGDF11 给脑 I/R 大鼠可诱导缺血区周围皮质的血管新生;促进内皮细胞增生;改善有效血流灌注并最终改善神经行为学评分。 （2）静脉注射 rGDF11 给脑 I/R 大鼠可激活缺血区周围皮质的ALK5/pSmad2/3 信号通路活动。腹腔注射 SB431542 可抑制 GDF11的促进血管新生和改善神经行为学评分的作用;提示ALK/Smad2/3信号通路活动可能参与了 GDF11 的血管生成机制。 （3）脑缺血可诱导内源性 GDF11 在血液、脑缺血区周围皮质表达增加。 （4）ta-VNS促进血管新生的作用可能与诱导GDF11的动员和再分布有关。