贻贝融合抗污蛋白涂层的制备与性能研究

• 作 者: 郑伟伟
• 出 处: 天津大学
• 发表日期: 2021年06期
• 关键词: 表面修饰 3 4-二羟基苯丙氨酸 抗污涂层 合成生物学技术 融合蛋白

在生物医学应用中,由蛋白质粘附、细菌或细胞接触附着繁殖等导致的生物污染会引发免疫排斥反应、血管支架再狭隘等问题。在基质表面构建抗污涂层是现阶段最常用的防止生物污染的方法。但是,目前构建抗污涂层通常需要涉及较为复杂繁琐的化学反应。因此,开发一种简洁高效且具有良好生物相容性的涂层制备方法具有十分重要的研究意义。受贻贝广泛普适的粘附特性启发,本文利用合成生物学技术设计制备了贻贝足丝蛋白-两性离子多肽(聚赖氨酸、谷氨酸)的融合蛋白。通过体外酪氨酸酶羟基化和体内共表达酪氨酸酶翻译后修饰的方法探索了融合蛋白中非常用氨基酸3,4-二羟基苯丙氨酸(多巴)的转化条件,并考察了融合蛋白的涂层形成能力和涂层抗污效果。首先将贻贝足丝蛋白(mussel foot protein)和两性离子多肽(poly KE)进行基因融合,构建重组质粒p ET-28a-MKE,利用大肠杆菌在37℃发酵表达贻贝融合蛋白fp-MKE。根据贻贝足丝蛋白酸溶性的特性,利用50%乙酸溶解之后5%乙酸溶液透析获得了纯度大于95%的贻贝融合蛋白fp-MKE。之后利用蘑菇酪氨酸酶体外催化融合蛋白中的酪氨酸残基转化形成多巴,制备含多巴的贻贝融合蛋白mfp-MKE,经计算其中多巴的转化效率约为11.36%。通过直接涂布的方法,贻贝融合蛋白mfp-MKE能在玻璃表面形成均匀致密的蛋白涂层。涂层抗污结果表明2 mg/m L贻贝融合蛋白mfp-MKE涂层能抵抗90%以上的蛋白质或细菌粘附。经检测,融合蛋白涂层溶血率低于0.1%,细胞共培养存活率高于99%,表现出优异的生物相容性。为了提高融合蛋白中多巴的转化效率,本文进一步将酪氨酸酶基因和融合蛋白基因共同导入大肠杆菌中,构建p ET-28a-MKE和p ACYC-Dute-1-TYR双质粒表达系统,以实现多巴在大肠杆菌中的翻译后修饰。利用大肠杆菌在16℃发酵表达蛋白,之后利用亲和层析制备了纯度高于70%的含多巴贻贝融合蛋白cofp-MKE,经计算其中多巴的转化效率约为59.09%。贻贝融合蛋白cofp-MKE能在钛、聚苯乙烯、玻璃等多种基质材料表面形成蛋白涂层。经石英微量天平测定,0.25 mg/m L贻贝融合蛋白cofp-MKE涂层蛋白粘附量仅10±0.3 ng/cm~2,且该涂层能抵抗80%以上细菌或细胞粘附。综上,通过合成生物学技术制备的贻贝融合抗污蛋白,可以在多种基质材料表面通过“一步修饰”构建高效抗污蛋白涂层。该方法依赖贻贝足丝蛋白的超强粘附特性,可以通过改变功能多肽序列实现多种功能涂层的构建,由此建立了多功能表面修饰平台,具有广泛的潜在应用前景。