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在世界范围内，牛支原体(Mycoplasma bovis, M.bovis)是一种主要引起牛的呼吸道疾病和乳房炎的病原菌，此外还可引起牛的中耳炎，关节炎等其他多种疾病。牛支原体在1961首次被从一例乳腺炎的病牛中分离得到，在1976年第一次被证明除了乳房炎外还可以导致呼吸系统病。牛支原体病在欧洲、美洲已经造成了极大的经济损失，在我国，2008年牛支原体才被首次报道，湖北省从外地引进的肉牛中，出现了以呼吸道疾病症状为主的疑似“牛肺疫”的疫情，最后该病经鉴定是由牛支原体感染引起的。人们现在逐渐认识到这种病对牛的健康、福利以及奶牛的生产力造成了极大的影响。但是由于多数牛支原体病临床症状统一，而且经常伴随其它病原菌的混合感染，以及我们对牛支原体知识的缺乏，导致牛支原体的诊断很困难，本研究主要目的是研究出一种针对牛支原体病原且操作简便，并且能够检测大量样本诊断方法，以适应临床上牛场的需要。本研究通过用牛支原体抗原免疫小鼠，制备了牛支原体单克隆抗体，并利用制备的单抗建立了牛支原体双抗夹心ELISA诊断方法，以下是本研究的主要内容: 1.牛支原体单克隆体的制备与鉴定: 本课题通过培养牛支原体，经过灭活、收集菌体制备了牛支原体抗原，免疫Balb/C小鼠，经过四次免疫后，制备免疫脾细胞，通过与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备了杂交瘤细胞株，通过利用间接酶联免疫吸附试验筛选出阳性克隆，通过三次有限稀释法对其中阳性杂交瘤细胞进行克隆，最后获得六株能够稳定分泌抗牛支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并对这些单抗进行了特性分析鉴定。经单克隆抗抗体亚型测定，这些单抗亚型都属于IgG类。腹水抗体效价在1×105～1.6×106。并对制备的单抗进行了特异性分析，结果表明六株单抗与临床分离并已鉴定为牛支原体的菌株以及国际标准株PG45都显阳性反应，但与牛的其他常见病原菌如多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌等都呈阴性反应，研究中所有的制备的单抗都与无乳支原体发生交叉反应，但是其中有两株单抗即1A5和1C11，除与无乳支原体有交叉反应外与其他测试支原体都无交叉反应。经western-blot验证出了6株单抗分别识别牛支原体全蛋白上的具体条带。该研究中制备的单抗为牛支原体双抗夹心检测方法的建立以及牛支原体致病机理研究奠定了基础。 2.牛支原体双抗夹心ELISA诊断方法的建立: 本研究以抗牛支原体单克隆抗体、多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为基础，建立了牛支原体双抗夹心ELISA诊断方法。该方法可以检测牛支原体的灵敏度为105 CFU/100μL，该方法能区分出除无乳支原体以外的其它测试支原体和牛的常见病原菌，特异性高，操作简便而且可以同时检测大量样本，而我国牛支原体检测提供了新的方法，该方法填补了国内用ELISA方法检测牛支原体抗原的空白，对我国牛支原体病的防控以及流行病学调查具有重要的意义。