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猪传染性胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一种呼吸道传染病，在临床和剖检上出现肺炎和胸膜炎的特征性症状和病变。本病遍布世界各地养猪业发达的国家和地区，近年来流行日趋严重，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。
预防和控制该病的主要措施是利用疫苗进行免疫接种。APP灭活疫苗在临床实践中证实可有效预防APP感染，但研究发现灭活疫苗对同种血清型具有较好的保护力，而对不同血清型的交叉保护性较差，使其广泛应用受到了限制。野外临床发现猪感染APP任何一种血清型后可产生抵抗不同血清型菌株感染的能力，为研制具有交叉保护活性的APP活疫苗提供了重要证据。而且弱毒活疫苗与传统疫苗相比，有能够重复提呈抗原和持续性刺激免疫应答的优点。因此通过缺失毒力因子构建弱毒活疫苗已成为国内外疫苗研究的热点。
鉴于上述背景，本研究旨在以标准APP1型菌株APP259为亲本菌，利用自杀性载体和同源重组的原理，敲除ApxⅠC和ApxⅡC基因的激活因子apxⅠ C和apxⅡC，构建不含抗性标记的APP双基因缺失株，研究其生物学特性的变化和对APP致病性的影响，探讨这种突变菌株作为疫苗的可能性，为最终研制出APP的基因工程弱毒疫苗奠定基础。主要的研究内容包括：
1.基因的克隆与重组自杀性质粒的构建
参照GenBank中apxⅠ、apxⅡ基因的序列，从APP259中扩增了apxⅠ C和apxⅡC基因的上下游片段。将得到的上下游片段，连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上，构建缺失了70bp的apxⅠ C基因的重组自杀性质粒pEMOC2△ⅠC和缺失了270bp的apxⅡC基因的重组自杀性质粒pEMOC2△ⅡC。
2.接合转移与缺失株APP90、APP85的筛选鉴定
以转化了重组自杀性质粒pEMOC2△ⅡC的大肠杆菌β2155为供体菌，1型菌株APP259为受体菌进行接合转移。涂布氯霉素((Cm)抗性平皿并转印到含10％蔗糖的平皿上，筛选Cm抗性((CmR)蔗糖敏感((Suss)的接合子。鉴定正确的接合子在TSB培养基中连续培养促使第二次同源重组的发生。涂布含10％蔗糖的平皿，并转印到Cm平皿上，筛选出Cm敏感((Cms)蔗糖抗性((SurR)的克隆，进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换，重组自杀性质粒已经丢失，从而构建单基因缺失株APP90。在单基因缺失株APP90(△apxⅡ C)的基础上，用转化了质粒pEMOC2△ⅠC的大肠杆菌β2155作为供体菌，单基因缺失株APP90(△apxⅡC)作为受体菌进行接合转移，用同样的方法构建胸膜肺炎放线杆菌△apxⅠ C△apxⅡ C双基因缺失株。
3.缺失株生物学特性的研究
在绵羊血平皿上测定APP259，APP90和APP85的溶血活性，结果显示APP259具有极强的溶血活性，单基因缺失株APP90(△apxⅡ C)具有较强的溶血活性，而双基因缺失株APP85(△apxⅠ C△apxⅡC)则失去了溶血活性。
将缺失株和亲本株都进行活菌计数，绘制生长曲线，结果表明，缺失株APP90和APP85与亲本菌比较，生长速度没有明显的变化，说明apxⅠ C和apxⅡC的缺失对APP259的生长无影响。
测定亲本菌和缺失菌在Balb/C小鼠体内的毒力，计算LD50。结果显示，与亲本菌APP259比较，单基因缺失株APP90(△apxⅡC)的毒力降低了约1.6倍，双基因缺失株APP85(△apxⅠ C△apxⅡ C)的毒力则显著下降。
4.双基因缺失株APP85(△apxⅠC△apxⅡ C)对小鼠的免疫试验及攻毒保护试验
将APP85和1型灭活疫苗分别免疫Balb/C6～8周龄小鼠，一免两周后二免，二免两周后攻毒。攻毒剂量为1.2×108cfu的血清1型菌(APP259)和1.0×108cfu的血清7型菌(APP265)。APP85免疫组对1型的保护率是87.5％，7型是75％。而灭活疫苗免疫组对1型和7型的攻毒保护率分别为50％和12.5％。所以弱毒菌株APP85在小鼠中的免疫效力优于传统灭活疫苗。