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研究目的与意义慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)与急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是常见的临床综合征,都具有发病率高、预后差、死亡率高等特点,是导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的重要因素与高风险因子,成为全球范围内重要的公共健康问题。越来越多的研究表明,AKI可通过血管损伤、炎症反应及间质纤维化等多种途径向CKD过渡或造成CKD进展,最终导致ESRD。肾脏纤维化是导致ESRD的共同途径,研究AKI与CKD的共同调控机制,阻断纤维化的发展是寻找治疗策略的关键。CLEC14A(C-type lectin family 14 member A)是一种新型模式识别受体(patternrecognition receptors,PRRs),属于C型外源凝集素超家族中的第14家族,血栓调节蛋白家族。同家族成员还包括CD93、THBD(thrombomodulin or CD141)、CD248(endosialin ortumorendothelial marker-1)三个分子。他们同属于I型跨膜蛋白,具有相似的结构,胞外区域都由一个外源凝集素样区域,数量不等的上皮生长因子样区域以及一个寿司样区域构成。这些成员除了都能介导细胞迁移和细胞粘附外,CD93还具有潜在的抗炎作用,能参与介导巨噬细胞发挥吞噬作用,清除体内凋亡细胞;THBD是天然抗凝剂,能够抑制炎性反应,促进细胞黏附;CD248可通过血小板衍生生长因子(PDGF)影响纤维化进程。虽然有研究表明CLEC14A能够促进血管新生,增强细胞黏附,但其在肾脏中的作用尚未报道,因此本课题将进一步研究CLEC14A在急性肾损伤和肾脏纤维化中的作用。研究方法与结果1 CLEC14A在肾脏缺血再灌注损伤模型中的表达变化1.1构建动物模型并检测CLEC14A的表达选取8-12周龄CBA/J野生型(wildtype,WT)雄性小鼠及CLEC14A缺失型(Clec14a-/-)雄性小鼠,随机分为两组,即对照组与模型组。小鼠进行麻醉后固定四肢。对照组沿腹中线打开腹腔,35min后缝合;模型组打开腹腔后,摘除单肾,微动脉夹夹闭对侧肾肾蒂,37℃缺血35min后取下动脉夹,待血液复流后进行缝合。分别于1、3、7、14天(d)进行肾脏取材。采用多种方法检测肾脏组织中CLEC14A的表达情况。结果显示,CLEC14A在模型组小鼠肾脏组织中的表达水平显著降低。1.2构建体外模型并检测CLEC14A的表达体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),并通过不同的方法进行模拟缺氧处理:使用Eagle培养基在低氧环境(1%O2)培养3h后复氧;抗霉素A/2-脱氧葡萄糖(AA/2DG)处理60min后转为正常培养;使用含氯化钴(CoCl2)的培养基培养24h。WB检测HK-2中CLEC14A蛋白水平的变化。结果显示,三种处理条件下,CLEC14A的蛋白水平均显著降低。2 CLEC14A在肾脏缺血再灌注损伤中的作用2.1检测小鼠血清中肾脏损伤指标分别检测对照组和模型组中WT与Clec14a-/-小鼠的血清肌酐及尿素氮含量。结果显示,在模型组中,Clec14a-/-小鼠血清肌酐、尿素氮水平较WT小鼠明显升高。2.2观察小鼠肾脏形态学损伤使用苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)对对照组和模型组中WT与Clec14a-/-小鼠的肾脏石蜡切片染色并观察,进行形态学损伤评分。采用原位末端转移酶标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL)对组织切片染色,检测细胞死亡,并进行统计学分析。IF检测小鼠肾脏中肾脏损伤分子-1(kidney injury molecule 1,KIM-1)的表达情况,并进行统计学分析。结果显示,与WT小鼠相比,Clec14a-/-模型组小鼠肾脏形态学损伤明显加剧,KIM-1表达水平明显升高,细胞死亡数目显著增多。2.3检测小鼠肾脏组织中炎症反应相关指标IF检测WT与Clec1 4a-/-小鼠肾脏石蜡切片中巨噬细胞标记蛋白CD68与中性粒细胞标记蛋白Ly6B的表达情况。结果显示,与WT小鼠相比,在Clec14a-/-模型组小鼠肾脏组织中存在更多浸润的巨噬细胞与中性粒细胞。3 CLEC14A在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的表达变化及作用3.1构建动物模型并检测CLEC14A的表达选取8-12周龄CBA/J野生型(wildtype,WT)雄性小鼠及CLEC14A缺失型(Clecl4a-/-)雄性小鼠进行造模。小鼠腹腔注射顺铂(30mg/kg),构建AKI模型。3天后进行肾脏取材。WB检测小鼠肾脏组织中CLEC14A的蛋白水平。IHC染色观察CLEC14A的表达情况。结果显示,CLEC14A在顺铂诱导的AKI模型小鼠肾脏组织中表达水平显著降低。3.2 CLEC14A在顺铂诱导的急性肾损伤模型中的作用HE染色检测小鼠肾脏形态学损伤,并对WT和Clec14a-/-小鼠肾脏进行形态学损伤评分。结果显示,在模型组小鼠中,Clec14a-/-小鼠较WT小鼠肾脏形态学损伤加剧,肾脏损伤更为严重。4 CLEC14A在单侧输尿管结扎模型中的表达变化及作用4.1构建动物模型并检测CLEC14A的表达选取8-12周龄CBA/J野生型(wildtype,WT)雄性小鼠及CLEC14A缺失型(Clec14a-/-)雄性小鼠进行造模。小鼠进行麻醉,沿腹中线打开腹腔,使用缝合线结扎单侧输尿管后进行缝合。分别于4、7、14天(d)处死小鼠,灌流后进行肾脏取材,对侧肾作为对照。分别使用实时定量PCR、WB及IHC染色检测肾脏组织中CLEC14A的表达情况。结果显示,CLEC14A在单侧输尿管结扎模型小鼠肾脏组织中表达水平显著降低。4.2检测小鼠肾脏纤维化相关指标WB检测WT与Clec14a-/-小鼠肾脏组织中Collagen 1、Vimentin及α-SMA的蛋白水平。采用Masson三色染色法及天狼星红染色、法(sirius red staining)检测小鼠肾脏的纤维化水平。结果显示,与WT小鼠相比,Clecl4a-/-小鼠肾脏纤维化更加严重。4.3检测肾脏形态学损伤利用HE染色对小鼠肾脏形态学损伤进行检测。结果显示,Clecl4a--小鼠肾脏形态学损伤较WT小鼠更加严重。4.4检测小鼠肾脏组织中炎症反应相关指标IF检测WT与Clecl 4a-/-小鼠肾脏石蜡切片中巨噬细胞标记蛋白CD68与中性粒细胞标记蛋白Ly6B的表达情况。结果显示,与WT小鼠相比,在Clec14a-/-模型组小鼠肾脏组织中存在更多浸润的巨噬细胞与中性粒细胞。5 CLEC14A在单侧输尿管结扎模型中的作用机制研究5.1 CLEC14A对TFAM表达的影响WB检测WT与Clec14a-/-小鼠肾脏组织中TFAM的蛋白水平。IHC染色检测TFAM在肾脏组织中的表达情况。结果显示,模型组肾脏中TFAM表达水平明显降低,CLEC14A的缺失使TFAM表达水平进一步降低。5.2 CLEC14A对线粒体功能的影响WB检测WT与Clec14a--小鼠肾脏组织中线粒体氧化磷酸化相关蛋白COXⅣ、ATP5A、NDUFB8、SDHB、UQCRC2 的蛋白水平。IHC 染色检测 COX Ⅳ在肾脏组织中的表达情况。结果显示,模型组肾脏中线粒体功能相关蛋白表达水平明显降低,CLEC14A的缺失使其进一步降低。5.3 CLEC14A对STING表达的影响WB检测WT与Clec14a-/-小鼠肾脏组织中STING的蛋白水平。IHC染色检测STING在肾脏组织中的表达情况。结果显示,模型组肾脏中STING表达水平明显降低,CLEC14A的缺失使STING表达水平进一步降低。研究结论与创新性1.本研究首次探讨了 CLEC14A在肾脏疾病中的功能与作用,发现在AKI及肾脏纤维化中,CLEC14A在肾脏的表达水平均显著降低。同时发现了CLEC14A的缺失在AKI及肾脏纤维化中可通过促进炎症反应、肾小管细胞死亡及间质纤维化等途径加重了肾脏损伤。2.本研究进一步证明CLEC14A在肾脏纤维化中的作用可能依赖于其对TFAM的正向调控,进而影响线粒体功能与STING信号通路。本研究有助于进一步阐明AKI及肾脏纤维化的分子机制,为以CLEC14A为靶点治疗肾脏疾病的可行性提供了一定的数据支撑和理论基础。