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【背景】
胰腺癌是一种高度恶性肿瘤，5年生存率约6%。近几十年之间，胰腺癌的发病率逐年上升，成为美国癌症死亡的第四位原因。据估计，2018年美国胰腺癌的新生患者高达55,440人，死亡人数为44,330人。由于胰腺癌早期症状隐匿，诊断困难，绝大多数患者在诊断时已经是中晚期。根治性手术切除是治愈胰腺癌的主要手段，能够显著延长患者的生存率。但是晚期患者肿瘤切除的机会有限，且常常伴有远处转移及神经浸润，从而错过最佳治疗时机。
胰腺癌发生和发展是一个多基因、多步骤、多因素的过程。早期研究表明，PC中常见的突变基因有TP53、K-Ras、CDKN2A/B和Smad4等。TP53是重要的抑癌基因，p53蛋白通路的异常改变是肿瘤细胞恶性转变的特征之一：50%肿瘤发生p53基因突变，80%肿瘤发生p53信号功能失调。p53依赖性的细胞周期阻滞和凋亡认为是p53介导的肿瘤抑制的关键。例如，过表达lncRNAMEG3通过调控p53信号通路抑制PC细胞的增殖。美国斯坦福大学Mello发现罕见的TP53激活性突变,即p5353,54位点突变,被认为超级肿瘤抑制蛋白。另外Mello发现p53可能会通过p53-Ptpn14-Yap的通路，从而Yap蛋白沉默，达到抑制胰腺癌发生发展的作用。还有研究发现PRIMA-1促进突变p53重新折叠，并诱导胰腺癌细胞中p53靶基因CDKN1A,使Rb蛋白不能发生磷酸化，从而使细胞周期停滞在G1期。可见p53作为重要的抑癌基因
在胰腺癌进展中发挥举足轻重的意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200nt、无编码蛋白质的功能内源性一类RNA。lncRNA拥有广泛的生物学功能，其中包括细胞凋亡、致癌、肿瘤侵袭、转移和血管生成。尽管lncRNA已被发现很多年，但过去一直被认为是基因组的转录“噪音”或“垃圾”，绝大多数lncRNAs的生物学功能仍然是一个谜。随着lncRNA的研究技术与方法逐渐改善，大量与恶性肿瘤相关的lncRNA被逐步揭开面纱。研究表明，lncRNA在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、肝细胞癌和白血病各种癌症中均有异常表达，并且在肿瘤恶性进展中担当重要角色。例如，lncRNAHOTAIR是重要的促癌因子，在肿瘤细胞增殖、迁移及转移中起着重要作用。LncRNAXLOC_000647抑制胰腺癌的进展，通过下调NLRP3降低上皮间质转移诱导的细胞侵袭。过表达lncRNAUCA1通过抑制Yap蛋白磷酸化增加Yap表达，而且可通过Hippo信号通路促进胰腺癌进展，可作为预后不良的候选生物标志物和新的胰腺癌治疗靶点。尽管在一些lncRNA被发现在胰腺癌中发挥重要作用，但仍有大量lncRNA在胰腺癌中扮演的作用还未知，尤其是与胰腺癌功能及机制的相关研究。因此有必要继续深入研究胰腺癌相关lncRNA在肿瘤发生发展中的分子机制，为胰腺癌诊疗提供新的思路。
本研究利用lncRNA芯片筛选在胰腺癌中差异性表达lncRNA，进一步对TCONS_00023867的表达进行验证和功能机制研究。结果表明TCONS_00023867在胰腺癌中低表达，并可能通过p53蛋白影响胰腺癌的增殖、侵袭和迁移等功能。本研究将有望为胰腺癌的诊疗提供新的靶点。
【实验目的】
1.探讨胰腺癌组织及癌旁组织中lncRNA的差异性表达情况，筛选出候选lncRNA进行功能学研究。
2.探讨lncRNATCONS_00023867对胰腺癌细胞的生物学功能影响及初步机制研究。
【实验方法】
1.对6对胰腺癌及癌旁组织进行lncRNA芯片检测，生物信息学分析筛选出具有差异性表达的lncRNA。综合考虑lncRNA表达信号值，P值，Foldchange值等因素，确定目标lncRNA。
2.利用qRT-PCR技术在胰腺癌组织样本及胰腺癌细胞系中验证TCONS_00023867表达情况。
3.合成TCONS_00023867的过表达质粒，通过CCK-8、平板克隆、Transwell实验、裸鼠皮下成瘤实验等，探索TCONS_00023867对胰腺癌细胞生物学功能的影响。
4.通过westernblot、免疫组化，探讨TCONS_00023867对p53蛋白的影响。
【实验结果】
1.通过基因芯片筛选分析，共检测26561个lncRNA。在选取的6对胰腺癌及其癌旁组织中，共有1587个lncRNA的表达有差异(foldchange＞2倍，P＜0.05)，其中包括903个上调的lncRNA和684个下调的lncRNA。最终通过比较差异表达lncRNA的表达量、差异倍数，P值等因素，筛选TCONS_00023867作为后续研究对象。
2.成功提取43例胰腺癌组织及癌旁组织中RNA，通过qRT-PCR检测TCONS_00023867在胰腺癌组织中低表达。分别提取五种胰腺癌细胞系(Capan-2、AsPC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、PANC-1)和正常胰腺导管上皮细胞HPDE6c-7中RNA，再次确认TCONS_00023867在胰腺癌细胞系中低表达。
3.通过CCK-8、平板克隆实验说明过表达TCONS_00023867后，胰腺癌细胞增殖能力减弱；通过Transwell实验证实，过表达TCONS_00023867后，胰腺癌细胞的迁移和侵袭功能减弱。进一步通过体内成瘤实验发现过表达TCONS_00023867后抑制胰腺癌细胞的成瘤能力。
4.通过westernblot实验及免疫组化发现，过表达TCONS_00023867后p53蛋白表达量升高。这提示过表达TCONS_00023867可能通过上调p53蛋白水平从而抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力。
【实验结论】
本研究发现部分lncRNA在胰腺癌中异常表达；进一步验证发现TCONS_00023867在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中低表达。过表达TCONS_00023867后可能通过升高p53的表达水平进而遏制胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的能力。我们研究表明，TCONS_00023867在胰腺癌中发挥重要作用，并可能成为胰腺癌新的潜在干预靶点。
胰腺癌是一种高度恶性肿瘤，5年生存率约6%。近几十年之间，胰腺癌的发病率逐年上升，成为美国癌症死亡的第四位原因。据估计，2018年美国胰腺癌的新生患者高达55,440人，死亡人数为44,330人。由于胰腺癌早期症状隐匿，诊断困难，绝大多数患者在诊断时已经是中晚期。根治性手术切除是治愈胰腺癌的主要手段，能够显著延长患者的生存率。但是晚期患者肿瘤切除的机会有限，且常常伴有远处转移及神经浸润，从而错过最佳治疗时机。
胰腺癌发生和发展是一个多基因、多步骤、多因素的过程。早期研究表明，PC中常见的突变基因有TP53、K-Ras、CDKN2A/B和Smad4等。TP53是重要的抑癌基因，p53蛋白通路的异常改变是肿瘤细胞恶性转变的特征之一：50%肿瘤发生p53基因突变，80%肿瘤发生p53信号功能失调。p53依赖性的细胞周期阻滞和凋亡认为是p53介导的肿瘤抑制的关键。例如，过表达lncRNAMEG3通过调控p53信号通路抑制PC细胞的增殖。美国斯坦福大学Mello发现罕见的TP53激活性突变,即p5353,54位点突变,被认为超级肿瘤抑制蛋白。另外Mello发现p53可能会通过p53-Ptpn14-Yap的通路，从而Yap蛋白沉默，达到抑制胰腺癌发生发展的作用。还有研究发现PRIMA-1促进突变p53重新折叠，并诱导胰腺癌细胞中p53靶基因CDKN1A,使Rb蛋白不能发生磷酸化，从而使细胞周期停滞在G1期。可见p53作为重要的抑癌基因
在胰腺癌进展中发挥举足轻重的意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200nt、无编码蛋白质的功能内源性一类RNA。lncRNA拥有广泛的生物学功能，其中包括细胞凋亡、致癌、肿瘤侵袭、转移和血管生成。尽管lncRNA已被发现很多年，但过去一直被认为是基因组的转录“噪音”或“垃圾”，绝大多数lncRNAs的生物学功能仍然是一个谜。随着lncRNA的研究技术与方法逐渐改善，大量与恶性肿瘤相关的lncRNA被逐步揭开面纱。研究表明，lncRNA在胰腺癌、乳腺癌、肺癌、骨肉瘤、肝细胞癌和白血病各种癌症中均有异常表达，并且在肿瘤恶性进展中担当重要角色。例如，lncRNAHOTAIR是重要的促癌因子，在肿瘤细胞增殖、迁移及转移中起着重要作用。LncRNAXLOC_000647抑制胰腺癌的进展，通过下调NLRP3降低上皮间质转移诱导的细胞侵袭。过表达lncRNAUCA1通过抑制Yap蛋白磷酸化增加Yap表达，而且可通过Hippo信号通路促进胰腺癌进展，可作为预后不良的候选生物标志物和新的胰腺癌治疗靶点。尽管在一些lncRNA被发现在胰腺癌中发挥重要作用，但仍有大量lncRNA在胰腺癌中扮演的作用还未知，尤其是与胰腺癌功能及机制的相关研究。因此有必要继续深入研究胰腺癌相关lncRNA在肿瘤发生发展中的分子机制，为胰腺癌诊疗提供新的思路。
本研究利用lncRNA芯片筛选在胰腺癌中差异性表达lncRNA，进一步对TCONS_00023867的表达进行验证和功能机制研究。结果表明TCONS_00023867在胰腺癌中低表达，并可能通过p53蛋白影响胰腺癌的增殖、侵袭和迁移等功能。本研究将有望为胰腺癌的诊疗提供新的靶点。
【实验目的】
1.探讨胰腺癌组织及癌旁组织中lncRNA的差异性表达情况，筛选出候选lncRNA进行功能学研究。
2.探讨lncRNATCONS_00023867对胰腺癌细胞的生物学功能影响及初步机制研究。
【实验方法】
1.对6对胰腺癌及癌旁组织进行lncRNA芯片检测，生物信息学分析筛选出具有差异性表达的lncRNA。综合考虑lncRNA表达信号值，P值，Foldchange值等因素，确定目标lncRNA。
2.利用qRT-PCR技术在胰腺癌组织样本及胰腺癌细胞系中验证TCONS_00023867表达情况。
3.合成TCONS_00023867的过表达质粒，通过CCK-8、平板克隆、Transwell实验、裸鼠皮下成瘤实验等，探索TCONS_00023867对胰腺癌细胞生物学功能的影响。
4.通过westernblot、免疫组化，探讨TCONS_00023867对p53蛋白的影响。
【实验结果】
1.通过基因芯片筛选分析，共检测26561个lncRNA。在选取的6对胰腺癌及其癌旁组织中，共有1587个lncRNA的表达有差异(foldchange＞2倍，P＜0.05)，其中包括903个上调的lncRNA和684个下调的lncRNA。最终通过比较差异表达lncRNA的表达量、差异倍数，P值等因素，筛选TCONS_00023867作为后续研究对象。
2.成功提取43例胰腺癌组织及癌旁组织中RNA，通过qRT-PCR检测TCONS_00023867在胰腺癌组织中低表达。分别提取五种胰腺癌细胞系(Capan-2、AsPC-1、BxPC-3、MIAPaCa-2、PANC-1)和正常胰腺导管上皮细胞HPDE6c-7中RNA，再次确认TCONS_00023867在胰腺癌细胞系中低表达。
3.通过CCK-8、平板克隆实验说明过表达TCONS_00023867后，胰腺癌细胞增殖能力减弱；通过Transwell实验证实，过表达TCONS_00023867后，胰腺癌细胞的迁移和侵袭功能减弱。进一步通过体内成瘤实验发现过表达TCONS_00023867后抑制胰腺癌细胞的成瘤能力。
4.通过westernblot实验及免疫组化发现，过表达TCONS_00023867后p53蛋白表达量升高。这提示过表达TCONS_00023867可能通过上调p53蛋白水平从而抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力。
【实验结论】
本研究发现部分lncRNA在胰腺癌中异常表达；进一步验证发现TCONS_00023867在胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中低表达。过表达TCONS_00023867后可能通过升高p53的表达水平进而遏制胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的能力。我们研究表明，TCONS_00023867在胰腺癌中发挥重要作用，并可能成为胰腺癌新的潜在干预靶点。