论文部分内容阅读
大丽轮枝菌是一种土传、植物性病原真菌，可以引起多种重要经济作物的枯萎死亡。一旦植物被感染后，尚无有效的防治措施。目前，大量的研究工作集中于病原菌毒力及致病关键基因的筛查。尽管农杆菌介导的遗传转化方法普遍用于外源基因的转化，但是仍然需要一种更加快捷的转化方法。本研究中，我们获得了高质量的大丽轮枝菌原生质体用于外源基因的遗传转化。利用此体系，获得了针对铁还原酶跨膜元件前体3(FreB，VDAG_06616)基因敲除突变体和回补体。随后，对FreB基因在病原菌铁还原酶活性以及毒力方面的功能进行了深入的研究。具体研究结果如下: 1.利用崩溃酶消化并获得了高质量的原生质体，在TB3液体培养基中再生效率可达65％。通过转化方式（电击和聚乙二醇）以及外源基因状态（线性DNA和质粒）对比发现:在PEG介导的遗传转化中，每微克线性GFP表达盒可得到600个转化子，每微克GFP质粒可得到250个转化子;电击遗传转化中，每微克线性化GFP表达盒可得到29个转化子，每微克GFP质粒可得到24个转化子。 2.为探索小干扰RNA（siRNA）能否成功导入原生质体并发挥基因沉默作用，针对上述研究获得的绿色荧光标记大丽轮枝菌(Vd-GFP)中的GFP基因，设计4种长度为19nt、3端具有两个突出碱基的siRNA片段（siRNA-gfp1，siRNA-gfp2，siRNA-gfp3和siRNA-gfp4），利用PEG介导的遗传转化方式分别将4种siRNA导入Vd-GFP的原生质体中。经液体培养后荧光检测发现:siRNA-gfp4沉默效率接近100％，其余siRNA沉默效率较低，约为10％。针对大丽轮枝菌附着力转录激活因子Vta2基因设计4种siRNA: siRNA-vta1，siRNA-vta2，siRNA-vta3和siRNA-vta4，将4种siRNA单独或混合导入到原生质体中，根据菌落直径测定和qRT-PCR分析可知:siRNA-vta1具有最高的沉默效率。 3.针对FreB基因，构建了敲除质粒和回补质粒，并通过PEG介导的原生质体转化技术，获得了该基因的缺失突变体(△FreB)和回补体（△FreB-C）。在不同的碳源（淀粉、蔗糖、半乳糖和纤维素）培养基上，△Fre的菌落直径和产孢量明显低于野生型和△FreB-C菌株，表明该基因可能与病原菌碳源利用存在密切关系。分别置于FeSO4、 FeCl3和无铁离子培养基上，△FreB的生长和产孢能力明显受到抑制，尤其是无铁离子耐受力下降最为显著。 4.与野生型菌株相比，△FreB铁还原酶活性下降了大约50％，而此能力在△FreB-C中得到完全恢复。同时，△FreB中与铁代谢途径相关的基因(Frect-4，Frect-5，Frect-6和Met)表达量均显著上升。通过平板扩散法施加100μM的过氧化氢时，△FreB对氧化胁迫高度敏感。与野生型和△FreB-C相比，△FreB对过氧化氢的敏感性高约25％。 5.通过病情指数统计，接种△FreB的烟草表型明显优于接种野生型和△FreB-C的烟草。这表明FreB基因与病原菌毒力紧密相关。 综上所述:本研究优化的原生质体转化系统可高效的实现外源基因的转化，并用于大丽轮枝菌致病力关键基因的筛查。此外，FreB基因与大丽轮枝菌的生长、细胞表面的铁还原、氧化胁迫的耐受性和致病力紧密相关，有可能作为防治大丽轮枝菌的候选基因之一。