铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统针状结构及其与LPS相互作用的研究

• 作 者: 何沿沿
• 机 构: 南开大学
• 出 处: 南开大学
• 发表日期: 2015年期
• 关键词: 细菌感染 铜绿假单胞菌 Ⅲ型分泌 毒性蛋白

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）是一种人类条件致病菌，常引起医院内获得性感染，如：免疫缺陷病人的感染和囊性肺纤维化病人的慢性感染。该菌拥有较多的毒力因子，这些毒力因子通常是细菌表面的附属结构或分泌到细胞外的毒性蛋白。其中Ⅲ型分泌系统（T3SS）通过将效应蛋白直接注入到宿主细胞中，引起宿主细胞凋亡。细菌表面附属结构脂多糖位于外膜的肽聚糖层，与蛋白质、磷脂等共同构成革兰阴性细菌的外膜，作为细菌的物理性屏障以阻止宿主细胞对其的吞噬。同时能够引起内毒素血症、脓毒症等症状。本文第一部分主要是用细菌双杂交的方法筛选能与T3SS结构蛋白PscN和PscO相互作用的其他T3SS结构蛋白。第二部分主要采用免疫荧光的方法，研究铜绿假单胞菌感染宿主细胞时，其毒性因子LPS的变化情况。　　本研究分为两个部分：第一部分，为了筛选T3SS中与PscN和PscO具有相互作用的蛋白，我们构建了84株细菌双杂实验菌株，并对蛋白的相互作用进行了检测。通过检测筛选出5个与PscN相互作用的蛋白，分别为PcrD、PscH、PopB、PopD、PscC；2个与PscO相互作用，分别为PscI和PscR。同时在PAK的背景下，我们分别敲除了pscH，pscO，exsC基因，发现当敲除pscH，pscO，exsC基因时，T3SS效应蛋白ExoS的分泌量大大减少，在相应突变株中回补pscH，pscO，exsC基因时，效应蛋白 ExoS的分泌量恢复到野生型水平，这说明 pscH，pscO，exsC正调控T3SS的效应蛋白的分泌。第二部分，在实验室前期研究发现，当铜绿假单胞菌Ⅲ型分泌系统被诱导表达时，脂多糖的脱落增多,而Ⅲ型分泌系统的组装是内外膜上，因此脂多糖可能会阻碍Ⅲ型分泌系统的组装。而脂多糖的脱落是否和Ⅲ型分泌系统的组装有关，目前还不清楚。为了研究脂多糖和Ⅲ型分泌系统的关系，我们采用免疫荧光的实验方法，首先用PAO1菌株侵染HeLa细胞，之后用红色荧光标记的鼠原IgG免疫标记脂多糖，观察细菌与宿主细胞接触部位脂多糖的变化情况。发现在细菌与宿主细胞接触的部位有脂多糖的脱落形成,说明Ⅲ型分泌系统的分泌能够导致脂多糖的脱落的形成。