论文部分内容阅读
TRAIL是一种典型的Ⅱ型跨膜蛋白，其细胞外区可被蛋白酶切割产生可溶性TRAIL，活性部分位于第114-281氨基酸区段(sTRAIL)。本课题以正常人外周血淋巴细胞总RNA为模板，扩增TRAIL的胞外区，插人原核表达载pBV220，于大肠杆菌中成功地表达了sTRAIL蛋白，经复性和纯化后，获得有生物学活性的重组人sTRAIL，并进行了初步的功能性研究。现将结果报告如下：
1.利用RT-PCR技术从正常人外周血单核细胞总RNA中扩增编码人TRAIL胞外区114-281氨基酸片断的cDNA，在5和3端引物分别引入酶切位点EcoRI和BamHI，并克隆到高效原核表达载体pBV220。
2.重组质粒经PCR鉴定及酶切图谱分析均与预期结果一致，序列测定表明目的基因同GeneBank报道的人TRAIL序列完全相同。
3.将重组表达载体转化大肠杆菌DH5α，通过温度诱导，目的基因主要以包含体形式高效表达，经SDS-PAGE鉴定，在相对分子量为19.6KDa左右处有特异表达蛋白，表达量占细菌总蛋白的30％左右，免疫印染显示其能被特异性多克隆抗人TRAIL抗体识别。
4.对包涵体进行分离溶解后，采用分步透析法复性蛋白，并用特异性ELISA法检测复性效果及对复性条件进行优化。结果显示TRAIL包含体蛋白在高浓度时可以获得满意的复性效果，并可采用离心法快速提纯，纯度大于96％。
5.体外抗肿瘤活性鉴定：选用K562细胞株。台盼蓝排斥试验和MTT法测试表明sTRAIL能抑制肿瘤细胞生长，有明显量效和时效关系；应用流式细胞仪检测表明sTRAIL能有效诱导K562细胞凋亡；DNA断裂实验的结果显示，经诱导的细胞出现了典型的DNA阶梯型条带。此外，电子显微镜下也观察到该细胞表现出典型的凋亡形态学特征。