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鞘脂(sphingolipids)除了作为真核生物中膜结构的重要组成成分外,在细胞的生长、分化、增殖、衰老及细胞凋亡过程中起着重要的作用。虽然植物鞘脂在程序性细胞死亡、植物抗病防御及信号传导中的作用也逐渐被人们所认识,但是,目前对植物鞘脂的了解仍然很有限。水稻(Oryza sativa L.)作为最重要的粮食作物之一,已成为单子叶植物研究的模式植物。水稻鞘脂代谢相关基因的研究,对.丁水稻抗病育种及性状的遗传改良具有重要的理论与应用价值。本文采用生物化学、分子细胞生物学和遗传学等方法对水稻鞘脂代谢途径中的重要酶之一神经酰胺激酶(OsCERK)的生物学功能进行了初步分析,为弄清植物中鞘脂的作用提供了重要的参考。
1)首先,采用RT-PCR及RACE方法克隆得到水稻神经酰胺激酶候选基因的全长cDNA序列。预测分析表明,3端具有串联的多聚腺苷酸加入位点,但并不影响其编码框,该基因编码607aa,是一个略偏酸性的蛋白；OsCERK序列中含有PH区域、保守的CXXXCXXC基序以及二酰基甘油激酶催化区域,还含有多个豆蔻酰基化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸位点和依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点。通过CLUSTALW比对,并用MEGA4.0构建系统进化树分析显示,CERK蛋白能很明显的聚成脊椎动物、无脊椎动物及植物几大类,而与CERK同源的鞘氨醇激酶及二酰基甘油激酶单独聚成微生物一类,推测CERK基因可能由LCB激酶或二酰甘油激酶基因进化而来,且CERK基因可能与植物的登陆及登陆后对环境的适应有关。
其次,通过半定量PCR和提取物的酶活性分析检测OsCERK基因表达模式,发现OsCERK基因主要在水稻叶片中表达,在根中表达很弱。采用脂质体介导和聚乙二醇介导的方法分别转染哺乳动物细胞和转化水稻原牛质体进行亚细胞定位分析,发现在HEK293和COS-7细胞中C端GFP标记的OsCERK蛋白都均匀的分布在细胞质中；在水稻原生质体中N端DsRed标记的OsCERK蛋白主要定位在类似叶绿体和线粒体的细胞器中,这为进一步分析OsCERK基因的功能提供重要的线索。
此外,体外分析重组蛋白OsCERK的生化特性表明,其最适的反应温度和pH值分别为40℃和7:蛋白的酶活性反应显示出典型的米曼氏动力学关系,且镁离子能有效增强其神经酰胺激酶活性,而钙离子对其作用并不明显；同时,应用特异的神经酰胺激酶抑制剂,发现重组OsCERK能被所用的抑制剂有效抑制,这进一步确认了神经酰胺激酶的活性。对OsCERK保守基序CXXXCXXC中三个半胱氨酸分别突变的研究表明,此三个半胱氨酸对神经酰胺激酶的活性非常重要。
最后,OsCERK基因互补拟南芥神经酰胺激酶突变体acd5的实验表明,所获得的纯合转OsCERK基因植株的表型与野生型一致,说明OsCERK基因互补了acd5的突变体表型。同时检测了植株在发育的各个时期PR1基因的表达、植株对细菌Pseudomonase syringae侵染的反应以及植株叶片提取物神经酰胺激酶的活性,实验结果都表明,OsCERK完全互补了神经酰胺激酶缺失突变体acd5,具有神经酰胺激酶的生物学功能。此外,通过摸索水稻“日本晴”的转化方法,共获得了约90株水稻OsCERK基因过表达、反义表达及RNAi T0代转基因植株,为后续的该基因的功能分析提供了良好的研究材料。